中华绒螯蟹生殖蜕壳后卵巢发育规律的研究
2020-09-23葛永春吴旭干
葛永春,吴旭干
( 1.上海海洋大学,农业部淡水种质资源重点实验室,上海 201306; 2.上海登瀛水产养殖专业合作社,上海 202164; 3.上海海洋大学,水产动物遗传育种上海市协同创新中心,上海 201306; 4.上海海洋大学,水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306 )
中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国最重要的养殖蟹类,2017年全国成蟹养殖产量为7.509×105t[1],产值500多亿元。性腺作为中华绒螯蟹的主要可食部位之一,其发育的优劣直接关系到中华绒螯蟹的食用价值和经济价值[2-3]。由于雌蟹的性腺指数远高于雄蟹,且雌蟹性腺(卵巢)中富含n-3高度不饱和脂肪酸、必需氨基酸和维生素等营养物质,因此卵巢发育良好的雌蟹(红膏蟹)市场价格较高[2-4]。此外,我国中华绒螯蟹养殖苗种主要依靠挑选池塘养殖亲本进行人工繁殖,所以中华绒螯蟹的卵巢发育情况直接关系到后续的交配繁殖[4-5]。
生殖蜕壳是短尾派蟹类自亚成体向成体过渡的一次关键蜕壳,中华绒螯蟹卵巢通常在生殖蜕壳后快速发育[3,6-7]。但是,蟹类蜕壳期间及刚蜕壳后非常脆弱,极易遭受敌害生物和同类的侵袭而死亡[8]。此外,池塘养殖过程中通常在中华绒螯蟹卵巢发育的后期投喂优质饵料进行育肥,以促进卵巢发育和提高营养价值[2,9]。因此查明中华绒螯蟹生殖蜕壳后的成活率和卵巢发育规律不仅对其在实际生产中的养殖管理有一定的现实意义,而且可以为学者们在科研工作中选择不同卵巢发育阶段的中华绒螯蟹雌体提供一定的基础资料。鉴于此,笔者以生殖蜕壳前雌蟹为对象,研究其在群体养殖条件下生殖蜕壳后的成活率、质量增加率和卵巢发育规律的变化,以进一步为中华绒螯蟹养殖管理、育肥和捕捞上市等提供基础资料和实践依据。
1 材料与方法
1.1 试验蟹及试验设计
试验蟹于2018年8月初取自上海崇明东风试验基地的室外养殖池塘。试验初期选取肢体健全、活力好且均处于生殖蜕壳前的雌蟹80只,体质量为50~70 g,放入室内2.5 m×3.75 m×1.0 m聚乙烯水桶中,暂养一周后开始正式试验。
试验共设计3个水桶,每个水桶内随机放入15只中华绒螯蟹,3个水桶随机标记为1#、2#、3#,并对每个桶内的中华绒螯蟹进行称量质量和标记,用油漆笔在蟹壳上标记为1#-1~1#-15,以此类推,以便于后续的观察。试验过程中,每日检查和记录死亡个体的数量、完成生殖蜕壳个体的数量和蜕壳时间。当发现中华绒螯蟹生殖蜕壳后的壳硬化后,取出称量质量并记录。为研究中华绒螯蟹生殖蜕壳后的卵巢发育规律,取生殖蜕壳后的30只雌体继续养殖60 d,每5~10 d解剖1次。具体的采样时间为6次:雌蟹生殖蜕壳后1~10 d、11~20 d、21~30 d、31~40 d、41~50 d、51~60 d。每个采样时间均随机解剖3只,记录其卵巢质量和体质量,同时取少量卵巢组织固定于波恩氏液中,以研究其生殖蜕壳后的卵巢发育情况。试验期间,每个养殖水桶中均放有聚氯乙烯板和水草等遮蔽物供蟹隐藏。
1.2 养殖管理
试验期间,每日18:00投喂配合饲料,投喂量为蟹体质量的1%~3%,次日8:00清除残饵和粪便,并根据残饵、水温和摄食情况适当调整投饵量。每隔8 h观察并记录中华绒螯蟹蜕壳和死亡情况,以便于统计蜕壳时间和成活率。一旦发现中华绒螯蟹蜕壳,立即将其放入单养塑料盒中,待蟹壳硬化后再用记号笔标注放入原先的养殖水槽中继续养殖。采用循环水工艺对养殖用水进行净化处理,定期采用曝气后的自来水来补充蒸发掉的水分。试验期间,24 h连续充氧,自然光照,试验期间自然水温19.2~28.5 ℃。养殖水体pH 7.0~8.5,溶解氧>4 mg/L,氨氮<0.5 mg/L,亚硝态氮<0.15 mg/L。
1.3 数据采集
1.3.1 质量增加率和死亡率
试验过程中,每日检查和记录完成生殖蜕壳和死亡个体的数量,当发现中华绒螯蟹生殖蜕壳后的壳硬化后取出称量质量,称量前用干毛巾拭去体表水分,电子天平称量(精确至0.01 g),测量完成后放回原处继续养殖。根据下式计算生殖蜕壳后的成活率和质量增加率:
成活率/%=(n1/n)×100%
质量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%
式中,n为蟹总数量,n1为生殖蜕壳后的存活数量,m1为生殖蜕壳前的体质量,m2为生殖蜕壳后体质量。
1.3.2 卵巢指数和组织学
试验过程中,根据中华绒螯蟹完成生殖蜕壳的时间,每5~10 d解剖1次。解剖后取出每只蟹的全部卵巢,电子天平称量质量(精确至0.01 g)后计算卵巢指数。
卵巢指数/%=m3/m×100%
式中,m为蟹体质量,m3为卵巢质量。
对波恩氏液固定的卵巢组织进行常规石蜡切片,切片厚度5.0~7.0 μm,苏木精—伊红染色后中性树胶封片,随后在显微镜下进行观察(Leica DM2500,德国徕卡公司),并采用自动数码摄像系统(Leica DFC295)进行拍照和图片处理。参考文献[10-11]的分期方法将中华绒螯蟹卵巢进行分期,并在显微镜下统计切片上15~20个卵细胞的卵径。各期的组织学特征为:Ⅰ期,卵巢内的主要细胞类型卵原细胞和卵黄合成前卵母细胞,细胞质呈嗜碱性;Ⅱ期,卵巢内可见大量椭圆形的内源性卵黄合成期卵母细胞(EN),细胞质呈嗜碱性;Ⅲ期,卵巢内主要细胞类型是外源性卵黄合成期卵母细胞(EX),胞质嗜碱性减弱并向嗜酸性转变;Ⅳ期,卵巢内为不规则的近成熟期卵母细胞(NO),胞质呈嗜酸性,且胞质内含有大颗粒卵黄物质;Ⅴ期,卵巢内为成熟卵母细胞(MO),卵黄颗粒较大且较均匀分布在整个细胞内。
1.4 数据处理
所有数据采用平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析, 用Levene法进行方差齐性检验,当数据不满足齐性方差时对百分比数据进行反正弦或者平方根处理,对试验结果进行单因子方差分析, 采用Tukey s-b(K)法进行多重比较;当数据转换后仍不满足齐性方差时,采用Games-Howell非参数检验进行多重比较。P<0.05为差异显著, 在Excel软件上绘制相关图表。
2 结 果
2.1 雌体生殖蜕壳后的质量增加率和成活率的变化
对雌体生殖蜕壳后的质量增加率和成活率进行统计发现,在本试验条件下生殖蜕壳后雌体的平均质量增加率为(54.60±4.93)%;而平均成活率为(71.11±3.85)%。
2.2 雌体生殖蜕壳后的卵巢指数和卵径的变化
中华绒螯蟹雌体在生殖蜕壳后20 d内卵巢发育较为缓慢(图1)。其中在中华绒螯蟹生殖蜕壳后10 d,雌体的平均卵巢指数为(0.45±0.02)%,而生殖蜕壳后20 d的雌体平均卵巢指数为(1.48±0.05)%。随着养殖的进行,卵巢发育进入快速阶段,生殖蜕壳后30 d雌体的平均卵巢指数为(2.05±0.21)%,至生殖蜕壳后40 d,雌体平均卵巢指数已显著增至(2.53±0.72)%。随着卵巢的进一步发育,待生殖蜕壳后50 d,雌体的平均卵巢指数已为(6.83±0.51)%。至生殖蜕壳后60 d,雌体卵巢指数进一步增至(7.43±0.23)%。统计分析发现,中华绒螯蟹雌体的卵巢指数和生殖蜕壳后的时间呈显著正相关(P<0.05,n=19)。两者之间为幂函数关系(y=0.3448e0.0565x,r2=0.90)。就卵母细胞长径而言,中华绒螯蟹卵母细胞长径与其生殖蜕壳后的时间亦呈显著正相关,待生殖蜕壳后60 d时, 雌体卵母细胞的长径可高达280 μm,两者之间为幂函数关系(y=29.328e0.0424x,r2=0.78)(图2)。
图2 群体养殖中华绒螯蟹雌体生殖蜕壳后卵母细胞长径的变化
2.3 雌体生殖蜕壳后的卵巢组织学变化
组织学观察发现,中华绒螯蟹生殖蜕壳后10 d的卵巢处于卵巢发育的Ⅱ期早期,卵巢中的细胞类型为卵黄合成前卵母细胞(PRO)和内源性卵黄合成期卵母细胞(EN)(图3a)。生殖蜕壳后20 d的雌体卵巢亦处于卵巢发育的Ⅱ期,但卵巢中的主要细胞类型已转变为内源性卵黄合成期卵母细胞(图3b)。随后,卵巢进入快速发育时期,生殖蜕壳后30 d雌体的卵巢发育至Ⅲ期,卵巢中的主要细胞类型为外源性卵黄合成期卵母细胞(EX)(图3c)。至生殖蜕壳后40 d的卵巢中的细胞类型仍为外源性卵黄合成期卵母细胞(图3d)。待生殖蜕壳后50 d,雌体的卵巢已经发育至Ⅳ期,卵巢中的细胞类型为近成熟期卵母细胞(NO)(图3e)。至生殖蜕壳后60 d,可观察到近成熟期卵母细胞内的卵黄物质进一步均质化(图3f)。
图3 群体养殖中华绒螯蟹雌体生殖蜕壳后卵巢组织学的变化
3 讨 论
3.1 雌体生殖蜕壳后的质量增加率和成活率的变化
甲壳动物的生长是通过周期性的蜕壳来实现的,而生殖蜕壳是蟹类由亚成体到成体阶段的最后一次蜕壳[3,6-7]。本研究结果表明,室内聚乙烯桶养雌体生殖蜕壳后的平均成活率为71.11%,其高于土池养殖中华绒螯蟹[12]生殖蜕壳后成活率(59.2%)。此外,本试验中每隔8 h观察一次,发现中华绒螯蟹蜕壳后立即将其保护起来,也保证了中华绒螯蟹生殖蜕壳后的成活率。本试验中中华绒螯蟹生殖蜕壳后的平均质量增加率为54.60%,这与土池养殖中华绒螯蟹[12]的质量增加率接近。
3.2 雌体生殖蜕壳后的卵巢指数和卵径、卵巢组织学的变化
甲壳动物的卵巢发育过程非常复杂,其受到温度、盐度、光照周期和饵料等多种因素的综合调控[13-14]。一般认为生殖蜕壳是蟹类卵巢发育的起点,生殖蜕壳后蟹类卵巢开始快速发育[12,15-16]。本试验结果表明,中华绒螯蟹雌体在生殖蜕壳后20 d内卵巢内的卵母细胞类型主要为内源性卵黄合成期卵母细胞,且卵巢指数增长缓慢,这可能是因为:(1)中华绒螯蟹雌体刚刚生殖蜕壳后,需要完成从内源性卵黄合成期到外源性卵黄合成期的转变,滤泡细胞迁移到卵母细胞四周需要一个过程[11];(2)刚刚生殖蜕壳后的中华绒螯蟹雌体需要优先在肌肉和肝胰腺中积累较多的营养物质,才能保证其后续正常卵巢发育[17]。随着养殖的进行,卵巢发育进入快速阶段,卵母细胞由内源性卵黄合成期卵母细胞发育为近成熟期卵母细胞,且卵巢指数急剧增加。
综上,本试验进一步探明了中华绒螯蟹雌体生殖蜕壳后的卵巢发育规律,这为中华绒螯蟹养殖管理、育肥和捕捞上市等提供基础资料和实践依据。中华绒螯蟹生殖蜕壳后20 d内卵巢发育较为缓慢,随后进入快速发育阶段,因此在今后的中华绒螯蟹养殖管理中,在中华绒螯蟹生殖蜕壳后的一段时间内应投喂足量的饵料以满足中华绒螯蟹后续的卵巢发育需求。此外,笔者通过规律间断采样探明中华绒螯蟹雌体生殖蜕壳后的卵巢发育规律,为今后科研工作中选择不同卵巢发育阶段的中华绒螯蟹雌体提供了参考资料。
4 结 论
将体质量为50~70 g的中华绒螯蟹雌蟹亚成体在室内放置遮蔽物的聚乙烯水桶中养殖至生殖蜕壳后,取出30只雌体继续养殖60 d发现,卵巢指数和生殖蜕壳后的时间呈显著正相关,两者之间为幂函数关系(y=0.3448e0.0565x,r2=0.90),卵母细胞长径与其生殖蜕壳后的时间亦呈显著正相关,两者之间为幂函数关系(y=29.328e0.0424x,r2=0.78)。