陇西县黄芪白粉病病原鉴定及其生物学特性测定

2020-09-22李金鸿徐雪芬李惠霞罗宁倪春辉李文豪徐志鹏

甘肃农业大学学报 2020年4期

李金鸿，徐雪芬，李惠霞，罗宁，倪春辉，李文豪，徐志鹏

(甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃兰州 730070)

黄芪(Astragalusmembranaceus)，多年生草本，高50～100 cm.主根肥厚，木质，常分枝，灰白色.茎直立，上部多分枝，有细棱，被白色柔毛.产于甘肃、内蒙古、山西、黑龙江等地[1].

甘肃省药用植物资源丰富，常年种植面积约为14.0万hm2，约占全国的20%，其中黄芪约占全国总面积和总产值的80%[2].白粉病是黄芪生产中一种常见的叶部病害，对黄芪产业的安全生产造成一定的威胁.据2012年调查,发病率55.5%～93.0%，严重度2～4级,严重影响黄芪的产量和品质.徐福祥[3]等报道其主要为害黄芪叶片、叶柄、嫩茎和荚果等部位.初期发病部位布满白色粉末状霉层.以后逐渐扩大蔓延,布满全叶、茎秆及荚果,整片叶子及荚果被白色粉状物所覆盖,后期变黑形成很多小黑点,严重时叶片呈黄褐色、干枯,造成早期落叶,叶片和茎秆同时受害,受害重的则整株枯萎.黄芪白粉病病菌于9月下旬形成子囊果,以子囊果在病残体上越冬[4-5].翌年5月份气温达到20℃以上时,病菌孢子萌发,首先感染二年生黄芪植株,出现发病中心,病菌迅速繁殖,重复侵染,叶片上出现白色粉状物,病菌孢子借风传播,并迅速向邻株蔓延,很快布满全田[6-8].

杨春清等[9]报道，北京、河北、内蒙古等地区黄芪白粉病病原为豌豆白粉菌(ErysiphePisiDC.)，任举[10]将甘肃省定西市黄芪白粉病病原鉴定为豌豆白粉菌 (Erysiphepisi) ，骆得功等[11]报道了甘肃省定西市黄芪白粉病的病原为黄芪束丝壳(Trichocladiaastragali)，在内蒙古白粉菌志[12]中记录，将黄芪束丝壳重新命名为黄芪白粉菌(E.astragali)，异名黄芪束丝壳.上述研究均是通过形态学特征进行鉴定，缺少分子生物学特征的比较.

本试验拟调查陇西县黄芪白粉病的发生情况，通过形态学结合分子生物学特征鉴定病原种类，并开展病原生物学特性研究，为该病害的及时有效防治提供依据.

1 材料与方法

1.1 调查方法与样品采集

1.1.1 调查地概况陇西县位于甘肃省定西市中部、渭河上游，地处陇中黄土高原中部，属温带季风气候，四季分明，日照充足，气候温和.年均降水量445.8 mm，蒸发量1 440 mm，年均日照时数2 292 h，年均无霜期146 d.

1.1.2 黄芪白粉病调查方法 2018年6～9月，采用五点法取样，调查陇西县巩昌镇、文峰镇、双泉乡、菜子镇、福星镇和首阳镇等6个乡镇.每个田块取5个点，每个点取黄芪10株，观察叶片的发病情况，白粉病发病分级标准见表1.

表1 寄主植物发病严重度的分级标准Table 1 Classification criteria for the severity of host plant disease

植株发病率(%)=(染病株数/调查总株数)×100%

1.1.3 供试材料 2018年6～9月采集陇西县黄芪白粉病叶片，制作腊叶标本，以备形态学观测.

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌形态学观察挑取发病叶片上的粉状物和子囊果，制成临时玻片，在显微镜(Lab.A1)下观察并测量有性阶段(子囊果形状、大小；附属丝长、宽度，颜色；子囊数量、形状，子囊孢子的形状、大小等)和无性阶段(菌丝体宽度、形态；分生孢子梗形状、大小；分生孢子形状大小；附着孢的形状；芽管萌发位置等)特征[11-16].根据观测结果，参照《内蒙古白粉菌志》[12]和《中国真菌志·第一卷·白粉菌目》[17]，进行病原菌鉴定.

1.2.2 病原菌分子生物学鉴定刮取新鲜病叶上的黄芪白粉菌，利用植物基因组DNA提取试剂盒(通用型)，提取菌株DNA组.采用引物ITS1(5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGTTATGC-3′)进行PCR扩增.PCR反应体系：2×Master Mix 25 μL、10 μmmol/L正反向引物各1 μL，基因组DNA 4 μg，双蒸水补足50 μL.PCR程序:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸60 s，循环30次，72 ℃延伸5 min[18].扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京擎科新业生物技术有限公司测序.所得序列在GenBank数据库中BLAST分析，下载高度同源的ITS序列，利用MEGA7软件采用MEGA7软件进行最大似然法分析，检测方法用自展法(Bootstrap)，构建系统进化树并分析亲缘关系，进一步明确病原菌的分类地位[19].

1.2.3 不同温度对分生孢子萌发的影响用无菌水配制成孢子悬浮液，每视野20～30个分生孢子，滴于凹面载玻片上，后置于15，20，25 ℃下保湿培养，8、16、24、32、40 h后镜检并统计萌发率.每个处理50个孢子，重复3次.

孢子萌发率 (%) =萌发的孢子总数/检查的孢子总数×100%[20].

1.2.4 不同pH值对分生孢子萌发的影响用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH配制pH值4、6、8、10的缓冲液，将孢子悬浮液(100(下每视野20～30个分生孢子)分别滴于不同pH值溶液的凹面载玻片上，25 ℃保湿培养.8、16、24、32、40 h 后镜检并统计萌发率[21].

1.2.5 不同碳源对分生孢子萌发的影响用无菌水配制2%无水葡萄糖溶液、2%麦芽糖溶液、2%乳糖溶液和2%甘露醇溶液，将孢子悬浮液(100(下每视野20～30个分生孢子)，滴于凹面载玻片上，分别滴加上述溶液，25 ℃保湿培养.8、16、24、32、40 h后镜检并统计萌发率[21].

1.2.6 不同光照条件对分生孢子萌发的影响用无菌水配制孢子悬浮液，将其涂在灭菌载玻片上，在25 ℃条件下设日光灯连续光照、光暗交替(L/D=4 h/4 h)、连续黑暗3个处理，每隔8 h镜检，统计40 h的萌发率[21].

2 结果与分析

2.1 调查结果

田间调查结果显示，陇西县黄芪白粉病平均发病率为31.17%，平均病情指数为18.08，6个乡镇大部分黄芪田块均有不同程度的侵染，乡镇之间白粉病发病率差异不明显.6月份黄芪开始受白粉菌侵染，9月份受侵染的叶片部分或整个片覆盖白粉，达到发病高峰期.

2.2 白粉菌形态特征

2.2.1 无性形态特征菌丝体叶两面生，生于叶柄和茎上，形成明显白色圆形斑片，覆盖整个叶面，存留或消失；菌丝体浅褐色，粗5～8(～13)μm，附着胞裂瓣状.分生孢子梗直立，足胞柱状，(18～)20～43(～49)×(2～)6～8(～12)μm，上接两个短细胞或1个长细胞(图1-A)；分生孢子梗大小为(37～)44～83(～98)× 7～14 μm，有1～2个隔膜；分生孢子单生，圆柱形或椭圆形，31～42(～48)×12～18 μm，平均值为38×15 μm(图1-B)；芽管自顶端萌发，大小为(3～)11～70(～91)×2～8 μm(图1-C).

2.2.2 有性形态特征子囊果聚生或散生，暗褐色，扁球形，直径为(86～)114～158(～189)μm，平均为134.752 μm，壁细胞为不规则多角形(图2-A)；附属丝(8～)11～18(～22)根，多数生于子囊果一侧，弯曲程度大，全长近等粗，常与菌丝交织在一起，粗3～8 μm，平均为4.95 μm，顶部稍宽为3～7 μm，平均为5.18 μm，长度为(27～)71～252(～316)μm，平均为141.86 μm，壁薄，光滑或稍粗糙，全长褐色，分支.子囊果内含子囊3～8个，子囊球形、不规则形，有柄，大小为(48～)58～79(～84)×(29～)32～42(～54)μm；子囊内含2～5个子囊孢子，子囊孢子呈卵性、球形或椭圆形，大小为10～26×5～18 μm((图2-B)).

A：分生孢子梗；B：分生孢子；C：芽管；D：附着孢.A：Conidiophores；B：conidia；C：Germ tube；D：Attached spore.图1 黄芪白粉菌的无性态特征Figure 1 The asexual characteristics of the powdery mildew on Astragalus membranaceus(Bar=10 μm)

根据病原形态特征，查阅相关书籍和资料，初步确定该病原菌为子囊菌门黄芪白粉菌(E.astragali).

2.2.3 分子生物学特征分析扩增得到的ITS-rDNA序列长度634 bp，将其命名为HQ，GenBank登录号为MK920921.在GenBank中进行BLAST同源序列比对发现，该ITS序列(MK920921)与沙打旺上的黄芪白粉菌Erysipheastragali(LC010028.1)ITS序列紧密聚集成一支，相似度为99.19%，遗传距离最小，亲缘关系近，如图3所示.因此，将该白粉菌鉴定为黄芪白粉菌(E.astragali).

A：子囊果；B：子囊和子囊孢子.A：Ascospores；Bar=50 μm；B：Ascus and ascospores,Bar=10 μm.图2 黄芪白粉菌的有性态特征Figure 2 The characteristics of the white powdery mildew

图3 基于ITS-rDNA序列构建的黄芪白粉病病原菌聚类分析树状图Figure 3 Phylogenetic tree of ITS -rDNA of powder mildew on Astragalus membranaceus

2.3 黄芪白粉菌生物学特性

2.3.1 不同温度对分生孢子萌发的影响黄芪白粉菌分生孢子在15、20和25 ℃时均能萌发，随着培养时间的延长，萌发率呈增加的趋势.其中，在25℃条件下，培养40 h时分生孢子萌发率最高，为32.0%.

2.3.2 同pH值对分生孢子萌发的影响白粉菌分生孢子在pH值为4～10条件下均可以萌发，且随着时间的延长，萌发率呈增加的趋势，其中，在pH值6和8条件下，更有利于孢子的萌发(图5).

2.3.3 不同碳源对分生孢子萌发的影响通过图6发现，2%麦芽糖溶液和2%乳糖溶液对白粉菌分生孢子的萌发影响不大，而2%葡萄糖溶液和2%甘露醇溶液对白粉菌分生孢子的萌发具有一定的抑制作用.

图4 不同温度对白粉菌孢子萌发的影响Figure 4 The effect of different temperatures on spore germination of powdery mildew

图5 不同pH值对白粉菌孢子萌发影响Figure 5 The effect of different pH on spore germination of powdery mildew

图6 不同碳源对白粉菌孢子萌发影响Figure 6 Effects of different carbon sources on the germination of powdery mildew spores

2.3.4 不同光照条件对分生孢子萌发的影响全光照的条件下，最有利孢子的萌发，光照黑暗(L/D=4 h/4 h)相间有利于孢子萌发；全黑暗最不利于孢子萌发.

图7 不同光照条件对白粉菌孢子萌发的影响Figure 7 The effect of different light conditions on spore germination of powdery mildew

3 讨论

通过田间调查发现，陇西县黄芪的白粉病一般6月下旬开始发病，在7月至9月上旬一直蔓延，9月中下旬减弱、趋缓，与周天旺等调查白粉病发生规律大致相同[6-8].

通过病原形态学观察，将陇西县黄芪白粉菌的病原菌鉴定为黄芪白粉菌(E.astragali).该病原形态特征与骆得功[6]等的研究结果基本一致.与杨春清等[9]和任举等[10]报道的豌豆白粉菌(Erysiphepisi)形态不同，形态差异主要表现在豌豆白粉菌子囊果附属丝顶端不分叉，附属丝无色，上下近等粗，局部粗细不均.而黄芪束丝壳子囊果附属丝顶端有1～2个分支，附属丝褐色，全长近等粗.在观察过程中，黄芪白粉菌子囊果附属丝顶端分支较少，在刘铁志[12]书籍中记载，附属丝未见分支可能是附属丝不成熟所致.