短乳杆菌来源重组β-半乳糖苷酶初步分离纯化与酶学特性研究

李 洁， 宫路路， 柳陈坚， 崔霖芸， 张 宁

（1.遵义医药高等专科学校基础教学部，贵州遵义563000； 2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

β-半乳糖苷酶，又称乳糖酶，英文名称βgalactosidase，简写为GAL，国际酶学委员会将其命名为 EC3.2.1.23［1］，为蛋白家族 GHF-2 类型.该酶能够水解乳糖，生成半乳糖和葡萄糖，用来回收乳清中的乳糖，生产功能性食品添加剂［2］.利用其水解活性水解牛奶中的乳糖，制成低乳糖牛奶，抑或制成肠溶片作为药物，治疗乳糖不耐受症［3］.利用其水解产物半乳糖作为供体，未分解的乳糖为受体，合成低聚半乳糖 GOS（galacto-oligosaccharide）［4］.由此可见，β -半乳糖苷酶在医药行业、食品行业上应用广泛［5］.

自然界中，产生β-半乳糖苷酶的生物种类很多，广泛存在于动物、植物、微生物［6］，尤其是微生物，如真菌、酵母菌、细菌.其中，研究较多的微生物有大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtils）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、乳杆菌（Lactobaills）、乳链球菌（Streptococcus lactis）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳酸克鲁维酵母（Klyeromyces lactis）、乳酸脆壁酵母（Klyveromyces lacis fragilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Asperillus oryzae）等［7］.

鉴于产β-半乳糖苷酶的微生物来源丰富，本研究以此为启发，以云南传统发酵豆豉为原料，进行β-半乳糖苷酶乳酸菌筛选.在宋园亮等［8］的努力下，筛选得到一株产β-半乳糖苷酶乳酸菌，经16S rDNA鉴定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）.结合分子克隆技术，将该菌来源β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中进行表达，得到一株产β-半乳糖苷酶重组大肠杆菌菌株，将其命名为 E.coli BL21／p ET28abgaB-18（以下简称18号菌株）.结合镍柱分离技术对重组菌株表达的β-半乳糖苷酶进行分离，并对其酶学性质进行测定.

1 实验部分

1.1 材料

1.1.1 菌种 本实验室保存的重组18号菌株.

1.1.2 试剂 卡纳霉素（TaKaRa 公司）IPTG；聚丙烯酰胺，考马斯亮蓝R-250，溴酚蓝，咪唑，NiSO4·6H2O（上海生工）；邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），ONP（Sigma公司）；碳酸钠（天津试剂三厂），磷酸二氢钠，磷酸氢二钠（天津市风船化学试剂）.

1.1.3 仪器 恒温摇床（上海智城分析仪器有限公司），超声波细胞破碎仪（天翎仪器TL-650Y）高速离心机（SIGMA K 3-18），镍柱（Qiagen），水平电泳仪（GENIUS），金属浴（FUNAKOSHI），普通恒温培养箱（NAPCO6500TC），紫外分光光度计（Genova）.

1.2 方法

1.2.1 β-半乳糖苷酶重组18号菌株诱导表达 吸取18号重组菌株20μL菌液接种至大肠杆菌培养基LB液体培养基5 mL中，加入20μL卡那霉素溶液（质量浓度为100μg／mL）后混匀.恒温摇床（温度为37 ℃，转速270 r／min）振荡培养12 h.吸取4 mL 培养液，扩大接种至400 mL LB液体培养基中，37℃，270 r／min 条件下培养，待菌体OD600达到0.6时，加入400 μL IPTG（200 mg／mL）诱导培养4 h.培养液于4℃，5 000 r／min离心10 min，弃上清液后加入磷酸盐缓冲液（pH值为7.5）4 mL，置于冰水内超声破碎，离心20 min（温度4 ℃，转速12 000 r／min）.收集上清液，沉淀，用磷酸盐缓冲液悬浮待用.

1.2.2 β-半乳糖苷酶重组18号菌株蛋白纯化 向经10 mmol／L PBS 平衡缓冲液（pH 7.4）处理的镍柱内加入1.2.1中的上清液，用不同浓度咪唑的平衡缓冲液冲洗镍柱，并收集；选择合适的收集液待用.

1.2.3 重组β-半乳糖苷酶蛋白SDS-PAGE电泳 分别取未纯化的细胞破碎液的上清液和沉淀，以及经镍柱纯化后的蛋白液各5μL，与5μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer混合，100℃煮沸10 min，13 000 r／min 离心 10 min；取离心上清液25μL进行SDS-PAGE电泳.

1.2.4 重组β-半乳糖苷酶酶活测定 β-半乳糖苷酶酶活单位定义为1 mL菌液产生的β-半乳糖苷酶在35℃、pH 7.5的条件下，每分钟水解ONPG产生1μmol邻硝基苯酚（ONP）所需要的酶量定义为一个酶活性单位，以U／mL表示.

反应体系为250μL重组β-半乳糖苷酶蛋白液，与等量体积ONPG溶液混匀，35℃恒温孵育30 min，加入250 μL 碳酸钠溶液终止反应［9］.检测反应体系在OD420处的吸光度.每个反应体系平行测量3次（下同），并计算酶活.

1.2.5 重组β-半乳糖苷酶最适温度和最适pH测定 将反应体系（详见1.2.4，下同）分别在不同温度（-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃）的水浴条件下进行酶促反应，结束后按照1.2.4进行检测.

在最佳反应温度下，将反应体系置于不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）［10］的缓冲液中进行酶促反应，结束后按照1.2.4进行检测.

现在当地乡镇派出所警力严重不足。由于基层警务需要承担大量的人口管理事务，两劳释放人员、精神病人、重点信访人员都属于基层警务的职责内容。警察执法在村庄社会中的重点是乡村治安，解决纠纷只是派出所功能的一部分[37]。在“羊吃花生”案中，“青楞”故意制造纠纷以报复自己用水不得。“青楞”侵犯的对象是村里的门头大户，“青楞”知道现在不能用拳头解决问题，于是才敢公然挑战权威势力。按理，“青楞”的行为应该受到制裁，但村干部的调解无法解决问题，而派出所严格依法办事，也不再理会警务职责之外的乡土利益诉求。

1.2.6 重组β-半乳糖苷酶热稳定性和pH稳定性测定 将重组β-半乳糖苷酶置于不同温度［11］（30、40、50、60、70、80 ℃）进行热处理 2 h，结束后按照1.2.4 进行检测.

将重组β-半乳糖苷酶置于pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 的缓冲液中处理 1 h［12］，结束后按照 1.2.4 进行检测.

1.2.7 金属离子对重组β-半乳糖苷酶活性影响的测定 吸取重组β-半乳糖苷酶纯化液25μL，依次加入225μL质量分数0.2%的CaCl2·2H2O、CuSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、Mg-SO4·7H2O、KCl、MnSO4、BaCl2和 ZnSO4等不同金属离子溶液，加入250μL ONPG溶液诱导培养，以未处理酶液作为对照，依据1.2.5的测定结果，选定最适温度、最适pH进行酶促反应，结束后按照1.2.4 进行检测.

1.2.8 初步纯化的重组 β-半乳糖苷酶 Km与Vmax测定 在35℃，pH 7.5条件下，测定不同浓度ONPG的酶促反应速率，根据米氏方程计算出β-半乳糖苷酶的Km和Vmax大小.

按照双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）将米氏方程改写为

根据酶活标准曲线计算不同［S］对应V，求出二者倒数，以1／V对1／［S］作图绘制直线.横轴截距为 x＝-1／Km，得 Km＝-1／x；纵轴截距为 y＝1／Vmax，得Vmax＝1／y，并计算出β-半乳糖苷酶Km和Vmax大小.

2 结果与讨论

2.1 重组β-半乳糖苷酶酶活测定在测定1.2.2中分离得到的重组β-半乳糖苷酶活性时发现，当按照1.2.4方法进行酶促反应时，吸取镍柱分离得到的重组β-半乳糖苷酶蛋白液250μL加入到含等量体积ONPG溶液的反应容器中，溶液立即变成黄色（黄色为反应产物ONP的颜色，反应前无色）.由于酶促反应时间很短，难以计算反应时间.其原因是酶浓度过高，反应进程过快，影响酶促反应速率测定，需探索重组蛋白的反应浓度.按照稀释倍数 45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 进行稀释，其结果如图1所示，在低于45倍浓度进行稀释时，稀释后的酶液与底物反应很快，很难把握酶促反应时间；继续加大稀释倍数，酶促反应速率逐步平缓下降.本实验选择稀释100倍（稀释便捷，反应时间可控，可检测性强）酶液参与酶促反应测定.

图1 酶促反应稀释倍数测定Fig.1 Determination of dilution multiple of enzymatic reaction

将酶液稀释100倍后，测定酶活，再换算成每1 mL重组大肠杆菌菌液酶活，得到重组β-半乳糖苷酶酶活为16.5 U／mL，即每1 mL重组大肠杆菌菌液的酶活为16.5 U.

2.2 重组β-半乳糖苷酶SDS-PAGE电泳图谱将1.2.2中纯化酶液进行SDS-PAGE电泳，其结果如图2所示.在泳道1中，66.2和35 kDa处有清晰蛋白条带，推测为重组β-半乳糖苷酶的2个亚基，电泳图谱中亦有杂蛋白条带.因此，该方法只能对重组蛋白进行初步分离纯化.

图2 重组菌株18号菌株SDS-PAGEFig.2 The SDS-PAGE figure of recombinant strain No.18

图3中，泳道1为重组菌株细胞裂解液上清液，在上清液中很难判断重组蛋白条带；泳道2为细胞裂解液沉淀，在细胞裂解液沉淀中可发现重组蛋白的表达（图3中大、小亚基所示）.由此可见，重组蛋白主要出现在细胞裂解液沉淀中，结合图2，则说明上清液中有重组蛋白，但与沉淀中蛋白量相比较少，蛋白主要在沉淀中，因此，该蛋白主要以包涵体形式存在于细胞中.

图3 18号菌株由来胞内蛋白电泳结果Fig.3 Results of intracellular protein electrophoresis of strain No.18

2.3 重组β-半乳糖苷酶最适反应温度和最适pH将β-半乳糖苷酶与ONPG混匀后置于不同温度条件下进行反应，待结束后测定其OD420的吸光度，绘制相对酶活曲线如图4（为便于数据处理，以下作图均按照相对酶活绘制）.可以看出，温度在0～35℃变化时，随着温度升高，相对酶促反应速率逐渐加快，35℃时达到最大.因此，得到其最适温度为35℃.随着反应体系温度升高，相对酶促反应速率逐渐下降：在35～50℃时，相对酶促反应速率下降缓慢；在50～85℃时，相对酶促反应速率下降明显；大于85℃时，相对酶促反应速率接近于0，推测酶在此时处于失活状态.

图4 Lb.brevis GJ1-3来源β-半乳糖苷酶最适反应温度Fig.4 The optimum temperature ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

将β-半乳糖苷酶与底物混匀后置于不同pH缓冲溶液中进行酶促反应，待结束后测定其OD420的吸光度，并探讨pH对该酶活性影响.根据实验测定结果，绘制相对酶活曲线如图5（以最大反应速率做参考）.可以看出，pH值为0～5.0时，相对酶促反应接近于0；pH值为5.0～6.5时，相对酶促反应速率迅速上升；pH值为6.5～8.0时，相对酶促反应速率比较稳定；pH值为7.5时，相对酶促反应速率达到最大，得到该酶最适pH值为7.5.当溶液pH值大于8.0时，相对酶促反应速率急剧下降；pH值为8.5～10.5的范围内，相对酶促反应速率接近于0，推测酶在此时处于失活状态.

图5 Lb.brevis GJ1-3来源β-半乳糖苷酶最适pHFig.5 The optimum p H ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

2.4 重组β-半乳糖苷酶热稳定性和pH稳定性将β-半乳糖苷酶与底物混匀后，置于不同温度条件下孵育2 h，在最佳反应条件下（35℃，pH 7.5）进行酶促反应，并测定其OD420的吸光度，绘制相对酶活曲线如图6.可以看出：在温度30～50℃范围内，酶稳定性较好；当温度升高到60℃以上时，相对酶活性急剧下降.推测酶在较高温度下空间结构遭到破坏，影响了酶促反应.因此，该酶在30～50℃范围内能够保持很好的热稳定性，较高温度条件下极易失活，属于常温酶.

图6 Lb.brevis GJ1-3来源β-半乳糖苷酶热稳定性Fig.6 The thermal stability ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

将该酶置于不同pH缓冲液中孵育1 h，随后将其置于最佳反应条件下反应，并测定其OD420的吸光度，绘制相对酶活曲线，探讨不同pH条件下酶促反应速率，如图7所示.结果表明：酶在pH值小于4.0的范围内，相对酶活接近于0，说明其稳定性很差；pH值为4.0～8.0时，酶稳定性逐渐增加；当酶处在pH值为8.0以上溶液中，其稳定性很快下降；pH值大于11时，相对酶活趋近于0，推测其结构遭到破坏而失活.由此可见，该酶在pH 6.0～8.0范围内具有较好的pH稳定性.

图7 Lb.brevis GJ1-3来源β-半乳糖苷酶pH稳定性Fig.7 The p H stability ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

2.5 金属离子对重组β-半乳糖苷酶活性影响将该酶与不同金属离子醋酸盐缓冲液（pH 7.5）混匀，测定不同金属离子对酶促反应速率的影响，结果见表1.

表1 金属离子对Lb.brevis GJ1-3来源β-半乳糖苷酶活性的影响Tab.1 Effects onβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3 by different irons

可以看出，在加入金属离子 Mg2＋、Mn2＋的反应体系中，与未添加金属离子对照组相比，重组β-半乳糖苷酶具有很好的催化活性，推测 Mg2＋、Mn2＋能够促进酶促反应；在加入金属离子Cu2＋、Ba2＋与K＋的反应体系中，重组β-半乳糖苷酶与未添加金属离子对照组相比，酶促反应速率都有所下降；Cu2＋存在时酶活性下降至三分之一，明显抑制了酶促反应；Ba2＋与K＋存在时，酶促反应速率也有一定下降.由此可见，Mg2＋、Mn2＋能够很好促进酶促反应，是该酶的激活剂；Cu2＋、Ba2＋与 K＋影响了酶促反应，具有一定抑制作用，为该酶反应抑制剂；其他金属离子对酶促反应影响不大.

2.6 重组β-半乳糖苷酶 K m与 V max将重组β-半乳糖苷酶与一系列不同浓度ONPG溶液（2、4、8、10、16、20 mmol／L）均匀混合，在最适条件下进行酶促反应，分别测定不同ONPG浓度下的酶活性，并绘制出1／V 对 1／［S］直线，如图8.通过计算得到Km＝0.816 mmol／L，Vmax＝45.87 mmol／（L·min）.

图8 Lb.brevis GJ1-3来源β-半乳糖苷酶的动力学结果Fig.8 The kineties ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

3 结束语

本研究将β-半乳糖苷酶重组18号菌株在IPTG的诱导下进行表达.表达蛋白经处理后分别进行SDS-PAGE电泳，结果如图2和图3.在图2中，第1泳道内有2个蛋白条带，其相对分子质量在 66.2 和35 kDa 附近.结合 Pridmore［6］等报道的短乳杆菌全基因组序列，以及其编码的β-半乳糖苷酶基因序列，利用DNAMAN软件预测β-半乳糖苷酶的结构发现，该酶有2个大小亚基构成：编码大亚基的核苷酸序列大小为1 887 bp，其编码的蛋白质亚基大小为71.6 kDa；编码小亚基的核苷酸序列大小为966 bp，其编码的蛋白质亚基大小为34.5 kDa.图2中蛋白条带大致在这个数值附近，然其位置不是很理想，需进一步探讨.除此之外，亦有杂蛋白出现，说明镍柱亲和分离效果不理想.在图3中，有2个表达量很大的蛋白，上清液中目的条带不明显.利用上清以及上清蛋白纯化液进行酶促反应时发现，加入酶液，反应变色，且反应瞬间结束，说明酶浓度高，底物相对较少，说明反应体系中有重组酶存在，且浓度很高，因此，需稀释酶液.由此可见，18号菌株表达的重组β-半乳糖苷酶主要以包涵体形式存在于细胞内，仅有部分酶蛋白存在于细胞裂解上清液中，需进一步优化重组菌株培养条件，改善其酶分泌情况.

重组β-半乳糖苷酶最适温度为37℃，属于常温酶，在30～50℃范围内热稳定性良好，50℃时能够保留90%的相对酶活；60℃时相对酶活降低到10%以下.潘渠等［14］研究嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶异源性表达时发现，β-半乳糖苷酶在60℃时仍能保持一半活性.说明温度对该酶活性影响较大，较高温度便会引起酶变性失活.重组酶最适pH值为7.5，在 pH 6.0～8.0范围内，稳定性较好；pH 6.0时，相对酶活降到10%以下；当pH值增加到10.0时，酶仍保留50%相对酶活.说明该酶对酸比较敏感，对碱适应能力较强.与聂春明［10］研究相比，酶的 pH适应范围较广.Mg2＋、Mn2＋对该酶活性有一定促进作用，其中Mg2＋促进作用较好，为酶的激活剂，Cu2＋为其抑制剂.Chanalia 等［13］在研究乳酸片球菌来源的β-半乳糖苷酶活性时发现，Ca2＋、Mg2＋和 Mn2＋对该酶具有活化作用.Wutor等［15］研究发现 Cu2＋也是该酶的抑制剂.聂春明［10］研究金属离子对乳酸杆菌来源重组β-半乳糖苷酶时发现，Mg2＋具有很好促进作用，高浓度金属离子会抑制β-半乳糖苷酶活性.宋园亮等［8］研究短乳杆菌β-半乳糖苷酶性质时发现，Mg2＋、K＋能够促进酶活性，Ba2＋和 Cu2＋抑制酶活性.说明Mg2＋为其激活剂，Cu2＋为抑制剂.潘渠等［14］将嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中进行了表达，测得重组菌株β-半乳糖苷酶的 Km＝2.18 mmol／L，Vmax＝273 mmol／（L·min）.在本研究中，经试验测得该重组β-半乳糖苷酶特征性常数Km＝0.816 mmol／L，最大反应速率 Vmax＝45.87 mmol／（L·min）.从 Km大小对比发现，短乳杆菌来源重组β-半乳糖苷酶与底物ONPG具有很好的亲和力，然而最大反应速率不是很高.酶经镍柱纯化后，酶蛋白基本达到电泳纯，但杂蛋白仍然存在.接下来将通过不同分离纯化技术，对酶液进行进一步分离提纯，获得更多关于短乳杆菌来源β-半乳糖苷酶的性质，为其工业化应用以及科学研究提供更为详尽的理论参考.