分泌型卷曲相关蛋白2抑制人结直肠癌细胞系SW480的增殖和迁移

周 菁，李索妮

(陕西省肿瘤医院 肿瘤内科，陕西 西安 710061)

结直肠癌(colorectal cancer)作为常见的消化道恶性肿瘤之一，近几年发病率逐渐增高。仅2014年中国结直肠癌新发病例就有79 180例，病死率高达13.27/10万[1]。其中癌细胞的转移是致死的主要原因[2]。因此，探索结直肠癌细胞转移的分子机制有望为其治疗提供有效的靶点。

分泌型卷曲相关蛋白2 (secreted frizzled-related protein 2，SFRP2)作为SFRP家族成员之一，三维结构中存在一个富含半胱氨酸的结构域，与Wnt配体高度同源，因此可以作为拮抗剂抑制Wnt/β-catenin信号通路[3]。SFRP2在一些恶性肿瘤中的表达失调已被报道，但是它在这些癌中的作用机制不尽相同。比如，在骨肉瘤[4]、肾癌[5]和乳腺癌[6]中呈现高表达具有促癌作用；然而，在胃癌[7]、结直肠癌[8]、口腔鳞癌[9]中，SFRP2高甲基化导致其表达下调，被认为具有抑癌作用。目前大多数学者只关注于SFRP2甲基化在结直肠癌检测中的应用，其抑癌的具体分子机制尚不清楚。本文通过检测SFRP2在结直肠癌细胞的表达，分析其对结直肠癌细胞系SW480增殖、迁移、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常结肠上皮细胞系(human normal colonic epithelial cell line)HCoEpiC、结直肠癌细胞系(human colorectal cancer cell line)SW480和人胚胎肾上皮细胞系HEK293T(美国典型培养物保藏中心)；RPMI1640和DMEM培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素(Thermo Fisher Scientificals公司)；慢病毒包装试剂盒(Origene公司)；CCK-8、BCA试剂盒(北京碧云天生物公司)；SFRP2、低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、Twist抗体(Abcam公司)；IDF-11774(Selleck公司)；FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；超低温高速离心机[SIGMA(3K15型)]。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养：将HCoEpiC和SW480培养于含10%胎牛血清，1%青霉素、链霉素的RPMI1640培养基中。培养条件：37 ℃，5% CO2。每隔2 d更换新鲜培养基。HEK293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件同上。

1.2.2 RT-qPCR检测mRNA水平：取处于对数增殖期细胞，采用RNA提取试剂盒提取RNA，Nanodrop测量260/280处吸光度值。取1 μg RNA作为模板，采用FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒检测mRNA水平，以GAPDH作为内参。每组实验设置3个复孔。mRNA表达量比较采用2-△△Ct计算，其中Ct=△Ct目的-△Ct内参，△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组。引物由上海生工合成。SFRP2上游引物：5′-GGAGACCAAGAGCAAGACCAT-3′，下游引物：5′-GCACTGCAAGCTGTCTTTGA-3′；β-catenin上游引物：5′-TACTGTCCTTCGGGCTGGTG-3′，下游引物：5′-CGGGTATCCTGATGTTGCGC-3′；Snail上游引物：5′-GGCTCCTTCGTCCTTCTCCTCTAC-3′，下游引物：5′-CCAGGCTGAGGTATTCCTTGTTGC-3′；HIF-1α上游引物：5′-TGCACAGGCCACATTCACGTA-3′，下游引物：5′-GTTCACAAATCAGCACCAAGCA-3′；Twist上游引物：5′-CGGCCAGGTACATCGACT-3′，下游引物：5′-CCATCCTCCAGACGGAGA-3′；GAPDH上游引物：5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物：5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。

1.2.3 Western blot检测蛋白水平：取处于对数增殖期的细胞，加入含有1 μmol/L PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min,离心30 min，收集上清。采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，取50 μg蛋白上样于分离胶为12%的SDS-PAGE上，160 V恒压1 h。湿转法恒流250 mA转移至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1h；加入一抗[SFRP2(1∶1 000)；β-catenin(1∶1 000)；Snail(1∶1 000)；HIF-1α(1∶1 000)；Twist(1∶5 000)]。4 ℃孵育过夜，PBST洗涤，二抗室温孵育1 h。曝光显影。

1.2.4 构建敲减SERP2稳转SW480细胞株及分组：首先将HEK293T细胞接种于6 cm培养皿中，孵育过夜后，进行转染，步骤按照说明书操作。48 h后，采用0.45 μm的滤膜过滤收集含有慢病毒的细胞上清。同时，将SW480接种至6孔板中，待细胞汇合度达到70%，加入收集到的含有慢病毒的细胞上清，4 d后，采用Western blot和RT-qPCR 检测SERP2的敲减效率。实验分组如下：1)shNC组，转染control shRNA;2)shSERP2组，转染SERP2 shRNA;3)shSERP2+ IDF-11774组，转染SERP2 shRNA的细胞，同时采用20 μmol/L IDF-11774处理。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖能力：将2×103个细胞接种于96孔板中，继续培养12、24和48 h后，向每孔内加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后，检测酶标仪450 nm处的吸光度值。

1.2.6 Transell小室法实验检测细胞迁移、侵袭能力：迁移：分别收集细胞，无血清培养液重悬，取5×104细胞接种于Transwell小室上层，下层加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养48 h后，用棉签将上层小室内中的细胞擦去，结晶紫染色30 min。倒置显微镜下观察细胞迁移数。侵袭：预先在Transwell小室上层铺一层Matrigel 基质膜，其他同迁移实验。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SFRP2在结直肠癌细胞系SW480及结直肠癌组织中的表达

SW480细胞中SFRP2的转录和翻译水平显著低于HCoEpiC细胞(P<0.01)(图1A,B)。另外，生物信息学数据库GEPIA显示(图1C)癌组织中SERP2的表达水平低于癌旁组织(P<0.05)。

2.2 敲降SERP2后SW480细胞增殖、迁移、侵袭能力增强

与shNC组比较，shSFRP2组细胞中SFRP2的表达水平显著降低(P<0.01)(图2A,B)；而增殖、迁移和侵袭能力显著提高(P<0.001)(图2C～E)。

*P<0.05 compared with normal samples；**P<0.001 compared with HCoEpiC group图1 SFRP2在结直肠癌细胞系SW480(A和B) 及结直肠癌组织中的表达(C)Fig 1 Expression of SFRP2 in colorectal cancer cell line SW480 (A and B) and colorectal cancer

A.Western blot;B.RT-qPCR;C.CCK-8;D,E.Transwell;*P<0.001 compared with shNC group图2 SERP2对SW480细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响Fig 2 Effect of SERP2 on proliferation,migration and invasion of SW480 n=3)

2.3 HIF-1α和Twist在SW480细胞中的表达

与shNC组比较，shSFRP2组HIF-1α和Twist表达水平明显提高(P<0.01)(图3)。

2.4 HIF-1α抑制剂(IDF-11774)降低SERP2敲降对SW480细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响

与shSFRP2组比较，shSFRP2+IDF-11774组细胞增殖、迁移、侵袭能力显著降低(P<0.001) (图4)。

3 讨论

研究发现54.39%的结直肠癌患者血浆样本中SFRP2存在高度甲基化[10]。因此，目前认为SFRP2是结直肠癌的抑癌基因。但是其与结直肠癌发生、发展的分子机制尚未清楚。

本研究首先确定了SFRP2在结直肠癌细胞系SW480中表达量低于正常上皮细胞。初步表明SFRP2在结直肠癌中可能是抑癌基因。SFRP2在Wnt通路中起关键作用，在绒(毛)膜癌[11]、骨肉瘤[4]、乳腺癌[6]中SFRP2能够促进癌细胞的侵袭、转移，具有促癌作用。然而在卵巢癌中发现TET1可以通过激活SFRP2表达抑制癌细胞的上皮间质转化，提示SFRP2具有抑癌作用[12]。本文敲降SFRP2后，发现结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力显著提高，表明了SFRP2在结直肠癌中为抑癌基因。

β-catenin、Snail、Twist是与EMT相关的转录因子，过表达能促进肿瘤细胞的上皮间质转化，导致肿瘤细胞从原发部位脱落，向周边组织转移[13]。本研究发现敲降SFRP2后，Twist表达水平显著提高，而β-catenin、Snail的表达水平并未受到影响。所以推测SFRP2通过调控Twist的表达抑制结直肠癌细胞的转移。目前已证实HIF-1α可以通过激活Twist的表达促进结直肠癌的增殖侵袭[14]。另外研究还发现HIF-1α表达受Wnt/β-catenin信号通路调控[15]，而SFRP2是Wnt配体的拮抗剂，因此推断SFRP2可能通过阻断Wnt/β-catenin信号传导来抑制HIF-1α表达，从而限制结直肠癌的进展。基于该推测，本文检测了HIF-1α在结直肠癌的表达，发现敲降SFRP2后，SW480细胞中HIF-1α表达水平显著升高。证实了在结直肠癌中SFRP2作为Wnt配体的拮抗剂首先抑制了HIF-1α表达，然后阻滞Twist激活，上皮间质转化受阻，最终控制了癌细胞的转移。紧接着，本文采用HIF-1α抑制剂(IDF-11774)刺激shSFRP2 SW480细胞，发现IDF-11774可以降低SERP2敲降对SW480细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。进一步说明了SFRP2通过调控HIF-1α-Twist信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭。

*P<0.001 compared with shNC group图3 HIF-1α和Twist在SW480细胞中的表达Fig 3 Expression of HIF-1α and Twist in SW480 cells n=3)

*P<0.001 compared with shSFRP2 group图4 IDF-11774对SW480细胞增殖(A)、迁移和侵袭能力(B和C)的影响Fig 4 Effect of IDF-11774 on proliferation (A),migration and invasion (B and C) of SW480 cells n=3)

综上所述，SFRP2可以抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭，可能是参与结直肠癌发生的负调控因子。后续可以尝试设计开发SFRP2激活剂用于结直肠癌治疗。