1α,25-二羟基维生素D3抑制人结肠癌细胞系SW480中β-catenin转录活性

辛 玉，贺龙梅，杨 红，吕 红，谭 蓓，汪红英*，钱家鸣*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 消化内科，北京 100730;2.中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院 国家癌症中心 国家肿瘤临床医学研究中心，北京 100021)

结肠癌(colon cancer)在中国的发病率呈快速增长趋势，1973—2005年男女性标化发病率分别由6.09/10万和5.70/10万增长至14.70/10万和14.35/10万[1]。维生素D(vitamin D，Vit D)与结肠癌的关系备受关注。日光照射时间短及纬度高的地区结肠癌病死率明显增加，提示Vit D可能抑制结肠癌发生发展[2]。1α,25-二羟基维生素D3(1α,25-dihydroxyvitamin D3，1,25(OH)2D3，又称骨化三醇)是Vit D在体内的活性形式。1,25(OH)2D3通过多种机制抑制结肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路[3-6]。

FOXM1(forkhead box M1)是叉头框(forkhead box，Fox)转录因子家族中的一员，其与肿瘤的发生发展密切相关。FOXM1可能参与到结肠炎癌转化过程。构建小鼠结肠炎癌模型，Rosa26FOXM1b转基因小鼠结肠肿瘤的数目及大小较野生型明显增多，而敲降FOXM1可抑制小鼠结肠成瘤[7]。近期一项有关胰腺癌的研究发现，维生素D/维生素D受体(Vit D/VDR)信号通路可明显抑制FOXM1的表达，抑制胰腺癌干细胞特性、增殖和转移[8]。FOXM1和β-catenin之间可能存在着一定的相互作用，然而目前尚未检索到结肠癌细胞中 β-catenin和FOXM1之间的相互关系的报道。本研究旨在探索1,25(OH)2D3对结肠癌细胞中FOXM1表达的影响，以及FOXM1和 β-catenin之间的相互关系，探究维生素D抑癌作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1α,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3](Sigma-Aldrich公司)；人结肠癌细胞系(colon cancer cell line)SW480和质粒TOP-FLASH(中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所汪红英实验室提供)；Trizol试剂、胎牛血清(FBS)、去DNA试剂盒和反转录试剂盒(Life Techonologies公司)；Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；DMEM/F12培养基、核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒(Thermo Fisher Scientificals公司)；兔抗人PARP、FOXM1单克隆抗体(Santa Cruz公司)；兔抗人HSP-90单克隆抗体(Abgent公司)；兔抗人β-catenin单克隆抗体(CST公司)。siRNA和阴性对照序列(上海吉玛制药技术公司合成)；引物(由上海生工生物工程有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：在含10%胎牛血清和1%青链霉素(penicillin streptomycin,PS)的DMEM/F12培养基中，置于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养人结肠癌SW480细胞，每2～3 d传代1次。收集对数增殖期的细胞进行实验。共分2组，即处理组和对照组，处理组：采用100 nmol/L 1,25(OH)2D3干预SW480细胞48 h，对照组：以相同体积的DMSO作为对照，干预SW480细胞48 h，每种处理设2个副孔。

1.2.2 质粒的扩增、提取及细胞的转染：TOP-FLASH质粒转化感受态细胞大肠杆菌DH5a，常规铺板，挑取阳性克隆，置于培养基中扩增，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，测定质粒浓度。siFOXM1序列为：上游引物：5′-GUGUCUCGGAAAUG CUUGUTT-3′；下游引物：5′-ACAAGCAUUUCCGAG ACACTT-3′；阴性对照序列为：上游引物：5′-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3′；下游引物：5′-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3′。培养细胞处于增殖期，以5×105个/孔的细胞数接种于6孔板上，过夜培养待汇合度达70%～80%开始转染。转染按照LipofectamineTM2000说明书分别将siFOXM1和阴性对照序列粉剂稀释成使用液后分别与LipofectamineTM2000混合制成转染混合液，最后分别将siFOXM1和阴性对照序列转染混合液加入6孔板。每次实验重复3次。

1.2.3 双荧光素酶报告系统和核蛋白提取：按10∶1的比例将TOP-FLASH和对照转染SW480细胞，24 h后加入100 nmol/L 1,25(OH)2D3，以相同体积的DMSO作为对照，干预48 h后收集SW480细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，采用荧光发光检测仪测定细胞中荧光素信号。100 nmol/L 1,25(OH)2D3干预SW480细胞48 h，以相同体积的DMSO作为对照，按照核蛋白-胞质蛋白抽提试剂盒说明书，分离胞核蛋白和胞质蛋白。

1.2.4 RNA提取及RT-qPCR检测β-catenin和FOXM1 mRNA：采用Trizol法提取细胞总RNA，去除总RNA中基因组DNA，然后反转录成cDNA，并采用SYBR-Green染料法进行RT-qPCR。β-catenin引物序列：上游引物：5′-TTGTGCGGCGCCATTTTA AG-3′，下游引物：5′-TCCTCAGACCTTCCTCCGTC-3′；FOXM1引物序列：上游引物：5′-CTGCAGGAC CAGGGAAAGAG-3′，下游引物：5′-CCACTTTGATG GGTCTCGCT-3′；GAPDH引物序列：上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物：5′-GCC CAATACGACCAAATCC-3′。

1.2.5 Western blot检测PARP、HSP-90、β-catenin和FOXM1蛋白水平：收集处理后的细胞，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，按RIPA蛋白裂解液∶10×蛋白酶抑制剂∶100×蛋白磷酸酶抑制剂=100∶10∶1的比例配置裂解液，处理细胞，冰浴30 min后收集裂解上清；用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白浓度；按总蛋白每孔50 μL加样，经SDS-PAGE分离，并转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂奶粉的Tween20/TBS溶液(TTBS)封闭1 h，加入一抗(兔抗人PARP抗体、HSP-90抗体、β-catenin抗体，1∶1 000；兔抗人FOXM1抗体，1∶200)4 ℃孵育过夜，复温1 h，TTBS洗膜3次，每次5 min，再加入相应二抗(1∶10 000稀释的羊抗兔和抗抗鼠抗体)，室温孵育1 h，TTBS洗膜3次，每次5 min，之后用增强化学发光剂显色。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 1,25(OH)2D3对SW480细胞中β-catenin转录活性、β-catenin定位及mRNA和蛋白水平的影响

与对照组相比，1,25(OH)2D3显著降低β-catenin的转录活性(P<0.05)(图1A)；HSP-90仅见于胞质蛋白，PARP仅见于胞核蛋白，结果提示胞核胞质蛋白分离质量良好，1,25(OH)2D3干预后的SW480细胞胞核蛋白中β-catenin水平较对照组明显减少(图1B)；然而，β-catenin mRNA和蛋白水平均无明显变化(图2)。

2.2 1,25(OH)2D3对SW480细胞中FOXM1 mRNA、蛋白水平的影响

与对照组相比，1,25(OH)2D3干预后的SW480细胞中FOXM1 mRNA水平无明显升高(图3A)；与溶剂对照组(control)相比，1,25(OH)2D3干预后的SW480细胞中FOXM1蛋白水平显著升高(P<0.05)(图3B)。

2.3 敲降SW480细胞中FOXM1降低1,25(OH)2D3对β-catenin转录活性的抑制作用

在mRNA水平，转染了siFOXM1的SW480细胞中FOXM1 mRNA水平较对照组(NC)显著降低(P<0.05)(图4A)；在蛋白水平，转染了siFOXM1的SW480细胞中FOXM1蛋白表达水平较NC显著降低(P<0.05)(图4B)。

1,25(OH)2D3显著降低β-catenin的转录活性(P<0.05)，敲降FOXM1后，β-catenin转录活性较1,25(OH)2D3组显著升高(P<0.05)(图4C)。

A.effect of 1,25(OH)2D3 on β-catenin transcriptional activity in SW480 cells;B.effect of 1,25(OH)2D3 on β-catenin protein expression of the nucleus in SW480 cells;*P<0.05 compared with control图1 1,25(OH)2D3对SW480细胞中β-catenin活性的影响Fig 1 Effect of 1,25(OH)2D3 on β-catenin activity in SW480 n=3)

A.effect of 1,25(OH)2D3 on β-catenin mRNA expression in SW480 cells;B.effect of 1,25(OH)2D3 on β-catenin protein expression in SW480 cells图2 1,25(OH)2D3对SW480细胞中β-catenin水平的影响Fig 2 Effect of 1,25(OH)2D3 on β-catenin expression in SW480

A.effect of 1,25(OH)2D3 on FOXM1 mRNA expression in SW480 cells;B.effect of 1,25(OH)2D3 on FOXM1 protein expression in SW480 cells;*P<0.05 compared with control group图3 1,25(OH)2D3对SW480细胞中FOXM1水平的影响Fig 3 Effect of 1,25(OH)2D3 on FOXM1 expression in SW480

A.effect of transfecting siFOXM1 on FOXM1 mRNA expression in SW480 cells;B.effect of transfecting siFOXM1 on FOXM1 protein expression in SW480 cells;*P<0.05 compared with NC group;C.effect of knock-down FOXM1 on the inhibition of 1,25(OH)2D3 in β-catenin transcriptional activity in SW480 cells;#P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 1,25(OH)2D3 group图4 转染siFOXM1对SW480细胞中FOXM1水平及对1，25(OH)2D3抑制β-catenin转录活性的影响Fig 4 Effect of transfecting siFOXM1 on FOXM1 expression and the inhibition of 1,25(OH)2D3 in β-catenin transcriptional activity in SW480

3 讨论

Vit D摄入和日光暴露与结肠癌呈负相关。1,25(OH)2D3是循环中Vit D的生物活性形式，与维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)结合，可通过抑制肿瘤细胞增殖发挥抑癌作用[9]。

1,25(OH)2D3抑制β-catenin转录活性[10]。β-catenin在细胞质中稳定、积累，进而入核，与TCF4/LEF-1结合形成转录因子，调控下游增殖相关基因的转录[11]。因此，细胞核中β-catenin的表达量显得更加重要。本研究结果显示，1,25(OH)2D3对SW480细胞中β-catenin mRNA和蛋白表达水平无影响，然而能显著降低β-catenin转录活性，与既往研究结果相一致[12]。本研究采用分离胞质胞核蛋白的方法，进一步证实1,25(OH)2D3可通过抑制β-catenin入核，降低β-catenin转录活性。

维生素D/维生素D受体(Vit D/VDR)信号通路可能通过作用于FOXM1抑制胰腺癌的生长和转移[13]，因此，FOXM1和Vit D/VDR信号通路在结肠癌细胞中的关系受到关注。结果显示，1,25(OH)2D3显著上调SW480细胞中FOXM1蛋白表达水平。目前，FOXM1与β-catenin相互关系的研究结果不尽相同。本研究首次提出1,25(OH)2D3通过上调FOXM1抑制β-catenin转录活性。与本结论相似的研究有：在生理情况下，敲除小鼠胚胎呼吸道上皮细胞中FOXM1基因，可导致β-catenin转录活性升高；在U2OS人骨肉瘤细胞中，敲降(或转染)FOXM1可提高(或降低)β-catenin转录活性[14]。此外，敲降人肺癌细胞A549和小鼠肺上皮细胞MLE-12中FOXM1,可导致β-catenin在细胞核中积累，进而提高β-catenin转录活性[14]。然而，也有研究提示FOXM1提高β-catenin转录活性。例如恶性胶质瘤方面的研究提示，FOXM1协同β-catenin入核，被β-catenin招募到β-catenin-TCF/LEF转录复合物上，促进转录复合物活化，进而增强β-catenin转录活性,促进下游基因的表达[15]。Vit D/VDR信号通路中FOXM1是否影响β-catenin入核仍需进一步深入研究。

近年来，有关Vit D/VDR信号通路在结直肠癌发病机制中的作用研究迅速发展，使人们对结直肠癌的发病机制有了更深入的认识，同时为结直肠癌的预防和治疗提供了新的靶点。然而体外环境单一，有别于复杂的体内环境，因此仍需动物实验进一步深入研究。