MicroRNA-155/FOXO3a在心脏手术后心房颤动患者心房组织中的表达及与心房纤维化的关系

冶敦清，祁国荣，路霖，王黎明

（青海省心脑血管病专科医院 心外科，青海 西宁 810000）

心房颤动（以下简称房颤）是最常见的持续性心律失常之一，可引起栓塞和卒中，且致残和致死率高[1]。随着我国人口老龄化加剧，房颤发病率不断增加，＞75 岁人群高达10%[2-3]。房颤常继发于风湿性心脏瓣膜病，有研究报道，风湿性心脏瓣膜病房颤患者存在明显心房重塑，其典型表现为心房组织纤维化[4-5]。叉头框蛋白（FOX）家族是一类广泛参与细胞增殖、分化及转化过程的转录因子，FOXO3a 是FOX 家族的重要一员，在细胞信号传导、生长发育、凋亡及抗氧化应激中起重要作用，其调控方式众多，涉及信号通路亦非常复杂[6]。有研究报道，硫化氢钠后处理可通过激活PI3K/AKT/FOXO3a/Bim 信号通路，减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤[7]。FOXO3a活性还受到miRNA调控，有研究发现miR-155 可靶向抑制FOXO3a 表达，与多种肿瘤及癌症发生有关[8-10]。另有研究发现，miR-155在慢性房颤患者右心房中表达上调，参与房颤的发生与维持[11]。然而关于miR-155/FOXO3a 在心脏手术后房颤患者心房组织中的表达及作用鲜有研究。因此本研究拟观察心脏手术后房颤患者心房组织中miR-155、FOXO3a表达水平，并探究其与心房纤维化的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月—2019年4月青海省心脑血管病专科医院收治的风湿性心脏瓣膜病并行心脏手术治疗的患者92 例。根据患者病史、心电图及24 h 动态心电图检查结果分为房颤组和窦性心律组，分别为43和49 例。纳入标准： ①心脏瓣膜病并且行心脏瓣膜置换术；②无伴发窦性心律；③有完整心电图及术前疾病相关指标检查资料；④房颤持续时间超过半年；⑤自愿参加本研究。排除标准： ①合并高血压、糖尿病等基础性疾病；②严重肝、肾功能不全或心力衰竭；③伴发恶性肿瘤；④急性感染或不耐受手术治疗。房颤组患者男性26 例，女性17 例；年龄33 ～79 岁，平均（57.64±9.83）岁。窦性心律组患者男性21 例，女性28 例；年龄26 ～78 岁，平均（54.27±10.95）岁。两组患者年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经过医院道德伦理委员会审批通过，样品采集及资料调查均取得患者及其家属知情同意并签字确认。

1.2 试剂及仪器

Trizol 试剂（货号： R0016）、蛋白抽提试剂盒（批号： P0028）及BCA 蛋白定量试剂盒（货号： P0010S）购自上海碧云天有限公司，PrimeScript ™RT reagent Kit（Perfect Real Time）（货号： RR037A）、PrimeScript ™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（货 号： 6210A）购自大连宝生生物工程有限公司，引物由上海吉玛生物科技有限公司合成，兔源p-FOXO3a 抗体（货号： MA5-32164）、FOXO3a 抗体（货号： PA1-805）、GAPDH 抗体（货号： AM4300）及二抗羊抗兔IgG（货号： 15135）购自美国Invitrogen 公司。紫外分光光度计购自美国Thermo 公司，7500 型qRT-PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司，1550P 型心电图机购自日本光电工业株式会社。

1.3 方法

1.3.1 样本采集在心脏外科手术时、心脏停跳前分别采集所有患者0.3 ～0.5 cm3右心房组织，除去杂质，分3 等份保存，2 份置于液氮中保存备用，1 份用4%甲醛固定，石蜡切片保存备用。

1.3.2 心房组织miR-155 及FOXO3a mRNA 水平检测Trizol法提取心房组织样品总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA 浓度及纯度。逆转录得到cDNA，置于-20℃保存备用。采用qRT-PCR 检测miR-155和FOXO3a mRNA 表达水平。采用20μl 反应体系： TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）10μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4μl，cDNA（50 ng/μl）2μl，正反向引物（10μmol）各0.8μl，ddH2O 6.0μl。反应条件为： 95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，共40 个循环。采用2-∆∆Ct法对心房组织中miR-155 及FOXO3a mRNA 的相对表达量进行定量分析。见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 FOXO3a 蛋白水平检测采用蛋白抽提试剂盒提取心房组织总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，置于-80℃冰霜冷冻保存备用。取60 mg 蛋白样品，80 mV 电压下6% SDS-PAGE 电泳2 h，250 mA 下PVDF 膜转膜70 min。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入适量含2%脱脂奶粉的PBS 稀释，加一抗（FOXO3a、p-FOXO3a 抗体1 ∶500；GAPDH 抗体1 ∶500）4℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜3 次，20 min/次，用适量含2%脱脂奶粉的PBS 稀释辣根过氧化物酶标记的二抗IgG（1 ∶5 000），室温孵育1.5 h，按上述方法洗膜，用免疫印记化学发光试剂显色，数字化多功能图像增强化学发光系统曝片，观察结果并进行分析。

1.3.4 心房组织纤维化程度检测心房组织切片经Masson 染色后于显微镜下观察，胶原纤维呈蓝紫色，肌肉组织呈棕红色。每张切片随机选取8 个400 倍视野，采用德国Leica 公司的多功能显微镜拍照，自动图像分析处理系统测定胶原容积分数，胶原容积分数=胶原面积/视野面积×100%。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比表示，比较用χ2检验，相关性分析用Pearson 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较

两组年龄、性别、收缩压、舒张压及左室射血分数比较，采用χ2/t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组左心房内径、右心房内径比较，差异有统计学意义（P＜0.05），房颤组高于窦性心律组。见表2。

表2 两组基线资料比较

2.2 两组心房组织纤维化程度比较

经Masson 染色后，房颤组心肌组织可见大量蓝色胶原纤维呈条索状分割包绕红棕色心肌细胞，胶原容积分数为（40.35±5.24）%，窦性心律组心房组织以红棕色心肌细胞为主，蓝色胶原纤维较少，胶原容积分数为（14.83±1.72）%，经t检验，差异有统计学意义（t=30.524，P=0.000），房颤组较窦性心律组高。见图1。

图1 心房组织病理切片 （Masson 染色×400）

2.3 两组心房组织miR-155、FOXO3a mRNA相对表达量比较

两组心房组织miR-155、FOXO3a mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），窦性心律组miR-155 低于房颤组，FOXO3a mRNA 高于房颤组。见表3。

表3 两组心房组织miR-155、FOXO3a mRNA相对表达量比较 （±s）

表3 两组心房组织miR-155、FOXO3a mRNA相对表达量比较 （±s）

组别 n miR-155 FOXO3a mRNA窦性心律组 49 1.13±0.12 1.06±0.18房颤组 43 3.58±0.54 0.49±0.10 t 值 30.923 30.346 P 值 0.000 0.000

2.4 两组心房组织FOXO3a 和p-FOXO3a 蛋白相对表达量比较

两组心房组织p-FOXO3a 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），房颤组低于窦性心律组。两组心房组织FOXO3a 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图2。

表4 两组心房组织FOXO3a 和p-FOXO3a 蛋白相对表达量比较 （±s）

表4 两组心房组织FOXO3a 和p-FOXO3a 蛋白相对表达量比较 （±s）

组别 n FOXO3a 蛋白 p-FOXO3a 蛋白窦性心律组 49 0.92±0.06 1.12±0.08房颤组 43 0.91±0.07 0.47±0.05 t 值 0.738 45.964 P 值 0.463 0.000

图2 心房组织FOXO3a 和p-FOXO3a 蛋白的表达

2.5 心房组织miR-155、p-FOXO3a 蛋白水平与心房纤维化程度的相关性

Pearson 相关性分析结果显示，房颤组心房组织miR-155 与p-FOXO3a 蛋白水平呈负相关（r=-0.485，P=0.000），与胶原容积分数呈正相关（r=0.490，P=0.000），心房组织p-FOXO3a 蛋白水平与胶原容积分数呈负相关（r=-0.471，P=0.000）。见图3。

图3 房颤患者心房组织miR-155、FOXO3a 蛋白与心房纤维化程度的相关性散点图

3 讨论

FOXO3a 是FOXO 家族中的亚族，广泛参与机体多种病理生理过程。FOXO3a 发生磷酸化可抑制FOXO3a 活性及其对靶基因的调控。周波等[7]研究报道，FOXO3a 可参与缺血再灌注损伤心肌损伤过程，激活PI3K/Akt 信号通路可使FOXO3a 发生磷酸化，并从细胞核转移至细胞质，减轻心肌细胞凋亡，同时可降低其下游蛋白表达。miR-155 是一个重要的心肌功能调控miRNA，徐黎青等[12]研究报道，乌司他丁可通过抑制体外循环心脏手术患者外周血单个核细胞中miR-155 表达水平，抑制TNF-α、IL-6、IL-8 等炎症因子的释放，发挥抗炎和心肌保护作用。WANG等[13]研究发现，接受消融术后房颤患者血清miR-155水平较术前较低。本研究结果发现，与窦性心律组比较，房颤组患者心房组织中miR-155 相对表达量较窦性心律组高，FOXO3a mRNA 及p-FOXO3a 蛋白相对表达量较窦性心律组低，且miR-155 与p-FOXO3a蛋白呈负相关，提示miR-155 可能通过抑制FOXO3a mRNA 及p-FOXO3a 蛋白表达，影响房颤发生。

房颤发生与维持的关键是心房重塑，包括结构重塑和电重塑。其中心房结构重塑包括心房直径扩大、肌间质改变和肌细胞超微结构改变[14-16]。HAN 等[17]研究报道，左心房直径每增加5 mm，房颤发生风险增加1.4 倍。本研究结果发现，与窦性心律患者比较，房颤患者左右心房内径均增大，提示心房直径扩大可能与房颤发生密切相关，与文献报道一致[18]。房颤患者心房结构重塑最突出特点为心房纤维化。心房纤维化即异常胶原纤维在正常心房肌间质中沉积，使正常心房肌间质中胶原纤维含量增加，进而导致心肌间质中不同类型的胶原蛋白比例失调、胶原纤维排列紊乱[19]。本研究通过形态学及半定量检测胶原蛋白结果发现，与窦性心律患者比较，房颤患者心房组织胶原容积分数升高，提示房颤患者心房存在不同程度纤维化病变。进一步分析发现，心房组织miR-155 水平与胶原容积分数呈正相关，p-FOXO3a 蛋白水平与胶原容积分数呈负相关，提示miR-155 可能通过抑制p-FOXO3a 蛋白水平表达与房颤患者心房纤维化，共同影响房颤的发生与维持。

综上所述，心脏手术后房颤患者心房组织中miR-155 高表达，p-FOXO3a 蛋白低表达，均与心房纤维化程度有关，共同影响房颤的发生与维持。但由于本研究样本量少，后期应加大样本量深入探究。