北京市市售生禽肉及社区居民冰箱耶尔森菌污染状况及分子特征研究

王丽丽，张 寻，段 然，陆 峥，魏 东，陈 倩

耶尔森菌属(Yersinia)是肠杆菌科中一类极具生物多样性的物种，目前已发现18个种[1]。其中已明确对人类致病的有鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)、假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)。条件致病的有弗氏耶尔森菌(Yersiniafrederiksenii)、中间耶尔森菌(Yersiniaintermedia)、克氏耶尔森菌(Yersiniakristensenii)等。本属细菌通常先引起啮齿动物、家畜和鸟类等动物感染，人类通过接触已感染的动物、食入污染食物或节肢动物叮咬等途径而被感染。

小肠结肠炎耶尔森菌是近年来受到全球重视的一种肠道致病菌，也是国际上公认的重要的食源性病原菌，人感染后导致耶尔森菌病(Yersinosis)，也可引起多种家禽、家畜发病。20世纪80 年代中期我国证实有2次流行，造成500多人感染。目前主要以低水平散发为主。由于该菌具有嗜冷性，是少数可以在冰箱低温储存食品中繁殖的病原菌之一，冰箱中存放的食物成为本菌的重要传染源，因此小肠结肠炎耶尔森菌病又被称为“冰箱病”。国内外有很多学者对生肉和冰箱冷藏食品小肠结肠炎耶尔森菌污染状况做了研究[2-3]，但是对居民冰箱耶尔森菌污染在食源性疾病传播中的作用研究较少。

本研究对北京市市售生禽肉及社区居民冰箱耶尔森菌污染状况进行监测，并对分离菌株的生物型、血清型、毒力基因携带情况、抗生素敏感性以及PFGE等分子特征展开研究,为开展食源性耶尔森菌监测溯源奠定基础。

1 材料与方法

1.1样品来源 2018年6-12月采集自北京市超市和农贸市场的生禽肉，样品包括预包装和散装的整鸡、鸡腿、鸡翅等共60件。同期采集的北京市社区居民冰箱冷藏室涂抹，共60件。

1.2试剂与仪器 改良磷酸盐缓冲液增菌液、CIN-I培养基、改良Y培养基、脑心浸液培养基购自北京陆桥技术有限责任公司、API 20E生化鉴定条购自法国生物梅里埃公司，胆盐-七叶苷平板购自英国Oxoid公司、小肠结肠炎耶尔森菌诊断血清购自郑州万泰生物科技有限公司，调节阳离子浓度的营养肉汤培养液及革兰阴性需氧菌药敏检测板由上海星佰生物技术有限公司生产，PCR反应体系试剂购自天根生化科技有限公司，限制性内切酶NotI、XbaI购自大连Takara公司，SeaKem Gold琼脂糖购自美国Cambraex Bio Seience Rockland公司，蛋白酶K购自德国Merck公司。PCR仪为CFX96、脉冲场凝胶电泳仪为Bio-Rad CHEF-DRⅢ系统，凝胶成像系统为 Bio-Rad Gel Doc 2000系统，均购自美国伯乐公司。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱为MALDI-TOF MS，购自德国Bruker公司。

药敏实验用质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。PFGE分子量标准菌株为沙门菌H9812。

1.3菌株分离方法 以无菌操作取生禽肉 25 g放入含有 225 mL 改良磷酸盐缓冲液增菌液，冰箱涂抹放入10 mL 改良磷酸盐缓冲液增菌液中，4 ℃增菌10～20 d后划线接种于耶尔森选择性平板CIN-I培养基，25 ℃ 24～48 h，采用MALDI-TOF对CIN选择性平板上“公牛眼”状形态可疑的菌落初步鉴定[4]，用API 20E 鉴定条和16S rRNA[5]进行确认。

1.4血清型鉴定 利用玻片凝集法对鉴定为小肠结肠炎耶尔森菌的菌株进行血清分型。

1.5毒力基因检测 按照参考文献[6-8]合成ail、yatA、ystB、yadA、rfbC、virF6种毒力基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增体系：采用20 μL反应体系，每个体系中加入2×Taq PCR Mastermix(KT201-01)10 μL，纯水 7 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。

1.6七叶苷代谢反应鉴定 将待测菌株点种于胆盐-七叶苷平板，置于25 ℃培养24 h后观察接种点周边培养基颜色变化[9]。

1.7耐药性测定 根据临床与实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)文件M100-S25推荐的药敏试验抗生素选择原则[10]确定耐药监测的抗生素名单，采用微量肉汤稀释法进行抗生素敏感试验，利用商品化药敏板条定量测定致病菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。按照相同的操作测定标准质控菌株ATCC 25922的耐药性。测试的抗生素包括30种，分别为氨苄西林(ampicillin，AMP，2～64 μg/mL)、氨苄西林-舒巴坦(ampicillin/sulbactam，AMS，2～64 μg/mL)、四环素(tetracycline，TET，1～32 μg/mL)、氯霉素(chloramphenicol，CHL，2～64 μg/mL)、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(trimethoprim/sulfamethoxazole，SXT，0.25～8 μg/mL)、头孢唑林(cefazolin，CFZ，0.5～16 μg/mL)、头孢噻肟(cefotaxime，CTX，0.25～8 μg/mL)、头孢他啶(ceftazidime，CAZ，0.5～16 μg/mL)、头孢西丁(cefoxitin，CFX，2～64 μg/mL)、庆大霉素(gentamicin，GEN，1～32 μg/mL)、亚胺培南(imipenem，IMI，0.25～8 μg/mL)、萘啶酸(nalidixic，NAL，4～64 μg/mL)、磺胺异噁唑(sulfisoxazole，Sul，32～512 μg/mL)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP，0.03～32 μg/mL)、阿莫西林-克拉维酸(amoxicillin/ clavulanate，AMC，2～64 μg/mL)、多黏菌素E(colistin，CT，0.5～16 μg/mL)、多黏菌素B(polymyxin B，PB，0.5～16 μg/mL)、米诺环素(minocycline，MIN，1～32 μg/mL)、阿米卡星(amikacin，AMI，4～128 μg/mL)、氨曲南(aztreonam，AZM，1～32 μg/mL)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP，0.03～32 μg/mL)、头孢吡肟(cefepime，FEP，0.25～16 μg/mL)、美罗培南(meropenem，MEM，0.06～4 μg/mL)、左氧氟沙星(levofloxacin，LEV，0.125～8 μg/mL)、多西环素(doxycycline，DOX，0.5～16 μg/mL)、卡那霉素(kanamycin，KAN，8～64 μg/mL)、链霉素(streptomycin，STR，4～32 μg/mL)、吉米沙星(gemifloxacin，GEM，0.015～16 μg/mL)、阿奇霉素(azithromycin，AZI，2～64 μg/mL)、头孢噻肟-克拉维酸(cefotaxime-clavulanate，CTX-C，0.12～4 μg/mL)、头孢他啶-克拉维酸(ceftazidime-clavulanate，CAZ-C，0.25～8 μg/mL)。根据CLSI的相应解释标准获得敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)的结果。

1.8PFGE分型 按照中国CDC编写的《小肠结肠炎耶尔森菌假结核耶尔森菌实验室分离与鉴定手册》[4]进行。主要实验参数如下：细菌悬液浓度用bioMérieux 麦氏比浊仪调至4.0～4.2；使用NotⅠ限制性内切酶(50 U)，37 ℃酶切 2 h；电泳参数为 2～20 s，19 h；电泳后使用GelRed染色，纯水脱色，读取电泳图谱；沙门菌标准株H9812作为分子量标准。PFGE图像录入BioNumerics (Version 7.6，Applied Maths，Inc.)软件，对电泳图像进行数据分析，构建聚类树状图。

2 结 果

2.1细菌分离、鉴定结果及毒力基因检测结果 经API 20E、质谱、16S rRNA鉴定并确认，本研究共分离到17株耶尔森菌，其中9株小肠结肠炎耶尔森、4株中间耶尔森菌、1株克氏耶尔森菌、1株Yersinia massiliensis、2株鲁氏耶尔森菌(表1)。

表1 北京市市售生禽肉和居民冰箱耶尔森菌生物型、血清型及毒力基因结果Tab.1 Biotype, serotype and virulence gene results of Yersinia bacteria of onsale raw poultry and household refrigerators in Beijing

2.2生物分型 对分离到的小肠结肠炎耶尔森进行七叶苷代谢反应鉴定，结果5株为七叶苷反应阳性，其中1株居民冰箱涂抹分离株为生物1A/O∶8型，2株市售生禽肉分离株为生物1A/O∶9型，2株市售生禽肉分离株为生物1A∶UN型。

2.3抗生素敏感性结果 17株耶尔森菌分离株中，头孢唑林、氨苄西林耐药率较高，分别为76.47%(13/17)、52.94%(9/17)，可能与这些菌株表达的β-内酰胺酶有关。对氯霉素、环丙沙星、复方新诺明、庆大霉素、米诺环素、阿米卡星、左氧氟沙星、多西环素、卡那霉素、链霉素10种抗生素100%敏感。各测试抗生素的耐药率和MIC50、MIC90见表2。

表2 北京市17株耶尔森菌抗生素敏感性Tab.2 Antibiotic sensitivity of 17 Yersinia strains in Beijing

对测试菌株进行耐药谱分析，发现2株小肠结肠炎耶尔森菌对多达11种抗生素耐药(表3)，其中Y8分离自社区居民冰箱涂抹，Y12分离自北京市某大型超市散装冰鲜鸡肉。1株分离自某品牌预包装鸡肉的克氏耶尔森菌Y18对9种抗生素耐药。2株分离自超市散装鸡肉的中间型耶尔森菌对所有测试抗生素均敏感。

表3 北京市17株耶尔森菌耐药谱Tab.3 Drug resistance spectrum of 17 Yersinia strains in Beijing

2.3PFGE分型 对17株耶尔森菌基因组经NotI酶切后进行PFGE分子分型，采用BioNumerics 软件对电泳条带进行聚类分析。分离自同一件样品的2株中间耶尔森菌Y7、Y10不能被NotI酶切。其他15株耶尔森菌得到14种PFGE带型(图1)，相似度为0～100%。分离自同一件生禽肉样品的2株小肠结肠炎耶尔森菌带型一致。

3 讨 论

作为一种近年来受到全球关注的人兽共患病病原体，小肠结肠炎耶尔森菌广泛存在于自然环境中，近年主要通过借助流行病学与分子分型手段识别暴发、开展分子流行病学研究。

小肠结肠炎耶尔森菌病目前在我国主要以低水平散发为主。由于其在低温环境下易于生长，所以是现代“冰箱病”的重要致病菌。本研究对2018年北京市市售生禽及社区居民冰箱耶尔森菌污染状况监测结果表明，生禽肉和居民冰箱耶尔森菌检出率分别为21.67%(13/60)和6.67%(4/60)。相关资料显示[7,11]，我国小肠结肠炎耶尔森菌病的流行菌型主要是血清型O∶3型和O∶9型。本研究仅检出了2株O∶9和1株O∶8血清型，未检出O∶3血清型，但需加强监测和防范，以便更客观掌握北京市小肠结肠炎耶尔森菌的主要血清型。

小肠结肠炎耶尔森菌可分为生物1A、1B、2、3、4、5型[12]。典型的致病性菌株为生物1B、2、3、4或5型，其中生物1B型为高致病性菌株，生物2型-5型为低致病性菌株。小肠结肠炎耶尔森菌的致泻作用普遍认为由耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin A)引起。近年来，部分产生类似耐热肠毒素A——耐热肠毒素B(heat-stable enterotoxin，Y-STb)的生物1A型菌株在腹泻病人中有较多报道，并在多起食源性疾病暴发与院内感染事件中被确定为病原[13]。基于人群的流行病学研究与动物实验表明，生物1A型菌株具有潜在的致病性。小肠结肠炎耶尔森菌O∶3、O∶5、O∶8、O∶9血清型为常见致病血清型。本研究分离的小肠结肠炎耶尔森菌中除1株不携带ystB基因外，其他8株生禽肉分离株和1株居民冰箱分离株均携带ystB基因，而其他基因均阴性，其中2株为生物1A/O∶9型、3株为生物1A/UN型、2株为非生物1A型、1株为生物1A/O∶8型，说明北京市市售生禽肉及居民冰箱均是耶尔森菌属所致食源性疾病的潜在传染源，应引起重视。

17株耶尔森菌分离株对头孢唑林、氨苄西林耐药率较高，分别达76.47%和52.94%，可能与这些菌株表达的 β-内酰胺酶有关。所有测试菌株对环丙沙星等10种抗生素均敏感。小肠结肠炎耶尔森菌对氨苄西林和一代头孢类抗生素天然耐药，对其他抗生素有不同程度耐药性。对测试菌株耐药谱分析，发现2株小肠结肠炎耶尔森菌对多达11种抗生素耐药，其中1株为携带ystB的生物1A/O∶9生禽肉分离株Y12，对第一、二、三、四代头孢均耐药，Y8对第一、三、四代头孢均耐药。另外，1株社区居民冰箱冷藏室涂抹克氏耶尔森菌分离株对9种抗生素耐药，在表型上表现为较强的耐药性。对于没有判别标准的吉米沙星、阿奇霉素、头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶-克拉维酸，本研究未做SIR判别，但是长期监测MIC50、MIC90，对于判断北京市耶尔森菌的耐药趋势具有重要意义。

值得的关注的是，我们在生禽肉样品SQ1中同时分离出3株小肠结肠炎耶尔森菌，其中2株菌Y3、Y4为非生物1A型，PFGE带型完全一致，而另1株菌Y5则为生物1A/O∶9型，与Y3、Y4的PFGE带型不同。另外，生禽肉样品SQ6同时分离出鲁氏、克氏和中间型耶尔森各1株，均为毒力基因全阴性。不同种、不同生物型别、不同血清型耶尔森菌的检出，也说明北京市市售生禽肉和居民冰箱中该菌的感染菌型并不完全相同，应引起我们更多关注。

利益冲突：无