类风湿关节炎患者氧化应激关键lncRNAs表达谱的筛选验证及相关性分析

文建庭 刘健 万磊 姜辉 忻凌 孙玥 孙艳秋 张颖 杜新雷 王馨 王杰

【摘 要】目的：檢测类风湿关节炎患者外周血单个核细胞（PBMCs）氧化应激关键长链非编码RNA（lncRNAs）表达谱的差异，结合临床进行验证，筛选出类风湿关节炎氧化应激分子标志物，并进行相关性分析。方法：采用高通量测序技术分别对3例类风湿关节炎患者和3例健康人的PBMCs进行检测，基因聚类和KEGG通路分析类风湿关节炎氧化应激差异表达的lncRNAs，Cytoscape分析lncRNAs、miRNA、mRNA之间的共表达网络图;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对20例类风湿关节炎患者和20例健康人差异表达lncRNAs进行验证，ROC曲线分析lncRNAs作为类风湿关节炎氧化应激分子标志物的潜力，相关性分析lncRNAs与临床指标及患者感受（SPP）之间的关联。结果：①高通量测序结果显示，类风湿关节炎氧化应激相关的差异表达lncRNAs是34个，上调19个，下调15个，差异倍数最高的7条lncRNAs是AC019117.2、LINC00630、AC007952.5、LINC00663、LINC00638、MIAT、PSMG3-AS1;②生物信息学分析显示，氧化应激关键lncRNAs主要富集在weigel oxidative stress response，weigel oxidative stress by hne and H2O2等上;③RT-qPCR结果显示，与健康人相比，AC019117.2、LINC00630表达显著升高（P < 0.05），AC007952.5、LINC00663、LINC00638表达显著降低（P < 0.05），MIAT、PSMG3-AS1的表达差异无统计学意义（P > 0.05）;④ROC曲线结果显示，AC019117.2、LINC00630、AC007952.5、LINC00663、LINC00638曲线下面积（AUC）分别是0.676，0.784，0.834，0.643，0.638;⑥相关性分析结果显示，AC007952.5与超氧化物歧化酶（SOD）、年龄呈负相关，与免疫球蛋白呈正相关;AC019117.2与病程、疾病活动度（DAS28）、视觉模拟评分法（VAS）评分、焦虑量表（SAS）、抑郁量表（SDS）呈正相关，与生理功能（PF）、生理职能（RP）、躯体疼痛（BP）、精力（VT）、社会功能（SF）、情感职能（RE）呈负相关;LINC00638与类风湿因子、抗环瓜氨酸肽抗体、免疫球蛋白M、VAS评分呈正相关，与RP、一般健康状况、VT、SF呈负相关;LINC00663与病程呈正相关，与SOD、红细胞沉降率、C-反应蛋白呈负相关。结论：类风湿关节炎患者PBMCs存在氧化应激相关差异表达的lncRNAs，其中AC019117.2、LINC00630、AC007952.5、LINC00663、LINC00638有望成为类风湿关节炎氧化应激相关的分子标志物。

【关键词】 关节炎，类风湿;氧化应激;lncRNAs;患者感受

【ABSTRACT】Objective：To detect the difference of lncRNAs expression profile of oxidative stress in PBMCs of patients with rheumatoid arthritis，and to screen out the molecular markers of oxidative stress and analyze the correlation.Methods：The PBMCs of three patients with rheumatoid arthritis and three healthy people were detected by high-throughput sequencing.Gene clustering and KEGG Pathway were used to analyze lncRNAs;Cytoscape was used to analyze the network diagram co-expressed between lncRNAs，miRNA and mRNA.qRT-PCR was used to verify the differential expression of lncRNAs in 20 patients with rheumatoid arthritis and 20 healthy people.ROC curve was used to analyze the potential of lncRNAs as a molecular marker of oxidative stress in rheumatoid arthritis.Correlation between lncRNAs and clinical indexes and SPP was analyzed.Results：①The results of high-throughput sequencing showed that there were 34 differential expressions of lncRNAs，among whcih 19 were up-regulated and 15 were down regulated，and the 7 lncRNAs with the highest multiple of difference were AC019117.2，LINC00630，AC007952.5，LINC00663，LINC00638，MIAT and PSMG3-AS1;②Bioinformatics analysis showed that lncRNAs of oxidative stress were mainly enriched in weigel oxidative stress response，weigel oxidative stress by hne and H2O2;③The results of RT-qPCR showed that compared with healthy people，the expressions of AC019117.2 and LINC00630 significantly increased（P < 0.05），the expressions of AC007952.5，LINC00663 and LINC00638 significantly decreased（P < 0.05），and the expression differences of MIAT and PSMG3-AS1 had no statistical significance（P > 0.05）;④The results of ROC curve showed that the AUC of AC019117.2，LINC00630，AC007952.5，LINC00663，LINC00638 were 0.676，0.784，0.834，0.643 and 0.638 respectively;⑤The results of correlation analysis showed that AC007952.5 was negatively correlated with SOD and age，and positively correlated with immunoglobulin;AC019117.2 was positively correlated with DAS28，VAS，SAS and SDS and negatively correlated with PF，RP，BP，VT，SF and RE;LINC00638 was positively correlated with rheumatoid factor，anti cyclic citrullinated peptide antibody，immunoglobulin M and VAS，and negatively correlated with RP，general health status，VT，SF;LINC00663 was positively correlated with the course of disease，and negatively correlated with SOD，erythrocyte sedimentation rate，C-reactive protein.Conclusion：There are lncRNAs related to oxidative stress in PBMCs of patients with rheumatoid arthritis，among which AC019117.2，LINC00630，AC007952.5，LINC00663，LINC00638 are expected to be molecular markers related to oxidative stress in rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;oxidative stress;lncRNAs;SPP

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜的慢性炎症、关节破坏及血管翳形成等为主要特征的疾病[1]。RA发病率高，发病机制尚不清楚，研究发现氧化應激产生的自由基参与RA的发病[2]。长链非编码RNA（lncRNAs）是一种长度 > 200 nt的调节性非编码RNA，由5'帽子结构和3'多聚腺苷酸（poly A）尾组成，可以通过ceRNA途径，发挥“海绵”样吸附作用，靶向调控miRNA[3-4]。研究表明，lncRNAs与肿瘤、自身免疫系统等多种疾病的发生、发展密切相关，并作为疾病早期诊断和预后的标志物[5-9]。前期已有研究证明，lncRNAs参与RA的发病，但氧化应激相关的lncRNAs在RA中表达情况及与RA关系的研究较少。故本研究通过高通量测序检测RA患者和健康人外周血单个核细胞（PBMCs）中lncRNAs表达谱的差异，并进行生物信息学分析，旨在筛选出与RA氧化应激相关的lncRNAs，进而为RA早期诊断、治疗及其他自身免疫炎症性疾病提供潜在靶点和新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年6月至2019年12月在安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院的RA患者20例，男3例，女17例;平均年龄（57.00±13.12）岁。20例健康人中男3例，女17例;平均年龄（55.19±10.49）岁。均符合美国风湿病学会（ACR）修订的RA分类标准[10];同时从健康体检中心选取基线一致的健康人20例作为健康对照组。2组患者在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。所有受试者均签署知情同意书。本研究经安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理号2018AH-19）。

1.2 PBMCs的分离及总RNA提取 分别抽取RA患者和健康对照组空腹外周静脉血5 mL，EDTA管抗凝，然后用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离PBMCs，根据TRIzol reagent的操作步骤提取总RNA。

1.3 试剂和仪器 Ficoll淋巴细胞分离液（GE Healthcare Bio-sciences AS，Sweden），TRIzol reagent（Life Technologies/Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），逆转录试剂盒（Prime ScriptTM RT reagent Kit），qTR-PCR试剂盒（SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ）均购自大连TaKaRa公司;引物由上海生工公司合成;实时定量PCR仪器购自美国Thermo公司。

1.4 高通量测序及生物信息学分析 高通量测序及生物信息学分析由上海典希生物医药科技有限公司完成。根据NEBNext超定向RNA文库试剂盒（NEB，Beverly，MA，USA）提供的说明，对纯化RNA进行第一链cDNA合成，最后在HiSeq3000（Illumina）上进行测序（2×150 bp）。基于GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto Encyclo-pedia of Gene and Genomes）数据库，对RA氧化应激关键差异表达的lncRNAs进行显著性富集分析，利用Cytoscape进行基因之间共表达网络分析。

1.5 RT-qPCR验证 应用逆转录试剂盒将总RNA逆转为cDNA，根据PCR试剂盒验证筛选差异表达的lncRNAs，采用2?△△ct法对结果进行定量分析，qRT-PCR以GAPDH为内参，引物序列信息见表1。

1.6 观察指标 ①患者一般情况：性别、年龄、病程等。②临床指标：超氧化物歧化酶（SOD）、红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、补体C3、补体C4。③患者感受（SPP）：疾病活动度（DAS28）、视觉模拟评分法（VAS）评分、焦虑量表（SAS）、抑郁量表（SDS）、健康调查简表（SF-36），其中SF-36量表由生理功能（PF）、生理职能（RP）、躯体疼痛（BP）、一般健康状况（GH）、精力（VT）、社会功能（SF）、情感职能（RE）、精神健康（MH）8个维度组成。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism version 6.0 （Graphpad Software，San Diego，CA，USA）软件进行统计分析。采用SPSS Statistics软件（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线），筛选lncRNAs差异表达的阈值为2.0倍以上（P < 0.05）。计量资料以表示，组间比较采用t检验，各参数之间的相关性采用Spearman相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高通量测序结果 对3例RA患者和3例健康人的PBMCs进行高通量测序，测序数据经归一化处理。结果显示，与健康对照组相比，RA组共有341种lncRNAs表达发生变化，对氧化应激相关显著差异表达的34个lncRNAs进行分层聚类分析，上调的有19个，下调的有15个，结果见图1。根据log2（FC）≥1.0或log2（FC）≤-1.0，且FDR≤0.05，选取显著性差异表达倍数最高的前7位lncRNAs进行分析，见表2。

2.2 生物信息学分析结果 KEGG通路分析得出，氧化应激关键lncRNAs主要富集在weigel oxidative stress response，weigel oxidative stress by hne and H2O2等。GO和Cytoscape分析得出2条RA氧化应激关键lncRNA-mRNA的网络图，以及lncRNA-miRNA-mRNA之间的网络图，见图2、图3、图4。

2.3 RT-qPCR验证 选取20对RA患者及健康人显著性差异最大的前7条lncRNAs，应用RT-qPCR检测2组lncRNAs的表达。结果显示，与健康人相比，AC019117.2、LINC00630的表达显著高于健康人（P < 0.05），AC007952.5、LINC00663、LINC00638的表达显著低于健康人（P < 0.05），MIAT、PSMG3-AS1的表達差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.4 ROC曲线分析 对差异有统计学意义的AC019117.2、LINC00630、AC007952.5、LINC00663、LINC00638进行ROC曲线分析，曲线下面积（AUC）分别为0.676，0.784，0.834，0.643，0.638，说明以上基因对RA均具有诊断价值。

2.5 lncRNAs与临床指标、SPP相关性分析 将氧化应激关键差异表达的lncRNAs与临床指标及SPP进行相关性分析，结果显示，AC007952.5与SOD（r = -0.32，P = 0.023）、年龄（r =  -0.32，P = 0.031）呈负相关，与IgA（r = 0.61，P = 0.017）呈正相关;AC019117.2与病程（r = 0.56，P = 0.011）、DAS28（r = 0.44，P = 0.014）、VAS评分（r = 0.55，P = 0.009）、SAS（r = 0.46，P = 0.010）、SDS（r = -0.56，P = 0.002）呈正相关，与RP（r = -0.42，P = 0.015）、BP（r = -0.54，P = 0.034）、VT（r = -0.56，P = 0.010）、SF（r = -0.55，P = 0.011）、RE（r = -0.42，P = 0.043）呈负相关;LINC00638与RF（r = 0.37，P = 0.000）、抗CCP抗体（r = 0.38，P = 0.010）、IgM（r = 0.47，P = 0.020）、VAS评分（r = 0.46，P = 0.003）呈正相关，与RP（r = -0.38，P = 0.023）、GH（r = -0.47，P = 0.026）、VT（r = -0.40，P = 0.034）、SF（r = -0.43，P = 0.045）呈负相关;LINC00663与病程（r = 0.47，P = 0.030）呈正相关，与SOD（r = -0.34，P = 0.003）、ESR（r = -0.41，P = 0.018）、CRP（r = -0.36，P = 0.048）呈负相关。

3 讨 论

RA早期得不到诊断和适当的治疗，最终可能导致关节畸形、功能丧失，严重影响患者的情绪、生活质量和社会功能等[11]。由于发病机制不清楚，缺乏特异性检查指标，目前尚无根治方法。氧化应激会导致中性粒细胞炎性浸润，促进活性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）自由基的大量产生，自由基可作为氧化剂和炎症介质参与RA病理过程[12]。因此，寻找与氧化应激相关特异性的、可早期诊断的分子标志物对于RA的早期诊断和治疗具有重要的意义。

近年来，由于高通量测序技术和各种生物学信息技术的发展，越来越多的lncRNAs在各种疾病中被发现且都发挥重要作用。到目前为止，lncRNAs在表观遗传、转录、转录后等水平影响基因的表达，甚至调节下游通路等。这预示着lncRNAs似乎具有更高的诊断和预后价值，不仅因为其组织和疾病特异性表达模式，还因为高度稳定的物理和化学性质[13]。这使得lncRNAs具有作为疾病分子标志物的潜能，进而为疾病的早期诊断、疗效评价、预后预测提供新的靶点。

本次研究通过对3例RA患者和健康人进行高通量测序，与健康对照组相比，RA组共有341种lncRNAs表达发生变化，对氧化应激相关显著差异表达的34个lncRNAs进行分层聚类分析，结果上调19个，下调15个。根据log2（FC）≥1.0或log2（FC）≤-1.0，且FDR≤0.05，笔者选取差异倍数最大的7个lncRNAs进行下一步临床验证，分别是AC019117.2、LINC00630、AC007952.5、LINC00663、LINC00638、MIAT、PSMG3-AS1。KEGG通路分析得出，氧化应激关键lncRNAs主要富集在weigel oxidative stress response，weigel oxidative stress by hne and H2O2等。GO和Cytoscape分析得出2条RA氧化应激关键lncRNA-mRNA的网络图，以及lncRNA-miRNA-mRNA之间的网络图。本团队前期对RA外周血PBMCs进行高通量测序，发现差异表达的lncRNAs主要与细胞凋亡、氧化应激和Notch通路有关[14]。有研究通过对9例RA患者和9例正常人PBMCs进行微阵列分析发现，2组间有2099个差异表达的lncRNAs，上调的有1099个，下调的有1000个[15]。

为了进一步分析上述lncRNAs，笔者选取20例RA患者和20例健康人进行RT-qPCR临床验证。结果显示，与健康人相比，AC019117.2、LINC00630的表达显著高于健康人（P < 0.05），AC007952.5、LINC00663、LINC00638的表达显著低于健康人（P < 0.05），MIAT、PSMG3-AS1的表达与健康人比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。同时，对差异有统计学意义的AC019117.2、LINC00630、AC007952.5、LINC00663、LINC00638经ROC曲线分析，AUC分别为0.676，0.784，0.834，0.643，0.638，说明这些lncRNAs都具有作为RA分子标志物的潜能，值得进一步关注。ZHENG等[16]通过微阵列芯片对10例RA患者和10例正常人标本进行circRNA筛选，结果表明，上调的circRNA有255个，下调的有329个，选用12个差异倍数较大的circRNA进行了40个临床样本的RT-qPCR验证，发现hsa_circRNA_104194与微阵列结果一致，所以推测hsa_circRNA_104194可能在RA基因表达调控中发挥作用，可作为后续功能与机制研究的候选基因。

目前，臨床上诊断RA的指标包括RF、抗CCP抗体、ESR、CRP、IgA、补体C3等。另外，SPP受到越来越多的关注，它是反映患者疾病以及治疗对其生理功能、心理健康、社会关系、治疗效果等方面影响的评价指标，国际上通常采用各种反映SPP的评分量表对患者治疗前后生活质量的变化进行评分，包括DAS28评分量表、焦虑抑郁量表（SAS、SDS）、简明健康状况调查问卷量表（SF-36）等[17]。另外，笔者将氧化应激关键差异表达的lncRNAs与临床指标及SPP进行相关性分析，结果显示，AC007952.5与SOD、年龄呈负相关，与IgA呈正相关;AC019117.2与病程、DAS28、VAS评分、SAS、SDS呈正相关，与PF、RP、BP、VT、SF、RE呈负相关;LINC00638与RF、抗CCP抗体、IgM、VAS评分呈正相关，与RP、GH、VT、SF呈负相关;LINC00663与病程呈正相关，与SOD、ESR、CRP呈负相关。ESR、RF、抗CCP抗体、SOD等是反映RA疾病活动度的重要临床指标，众多lncRNA也是通过竞争性结合miRNA，参与RA免疫炎症反应，诱导RA发病，而笔者研究也表明，氧化应激关键lncRNAs与临床指标密切相关。有研究认为，RA并发精神心理疾病、生活质量降低等与疾病活动相关，主要是由于免疫介导的炎症反应所诱导[18-19]。笔者研究也发现，lncRNAs不仅与免疫炎症等临床指标相关，也与反映患者情绪及生活质量的DAS28、SAS、SDS、SF-36等密切相关。LUO等[20]也通过微阵列芯片技术差异表达的circRNA进行实时定量PCR验证以及ROC曲线进行分析，发现hsa_cic_0044235在RA外周血中表达降低，所以推测其可作为RA临床血液样品诊断标志物，但是与ESR、CRP、RF、抗CCP抗体、DAS28无相关性。

综上所述，本研究通过高通量测序及生信学分析，并结合临床RT-qPCR验证及相关性分析，认为AC019117.2、LINC00630、AC007952.5、LINC00663、LINC00638可以作为RA氧化应激关键lnRNAs，但其作用机制尚不清楚。因此，我们今后将进一步深入研究RA氧化应激关键lncRNAs的机制，这有可能在临床上为RA早期诊断、靶向治疗和生存预后提供一个新思路。

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收稿日期：2020-02-15;修回日期：2020-03-30