索拉非尼联合贝伐单抗对小鼠宫颈癌细胞株U14移植瘤抑制作用的研究

吴林珍 鲁建央 孙亚青 胡志英

子宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，居女性恶性肿瘤死亡的第2位[1]，在我国，更是居女性恶性肿瘤死亡的首位[2-3]。随着对肿瘤细胞生长的分子调控机制的研究不断深入，针对恶性肿瘤的分子靶向治疗已经成为现代肿瘤学研究的热点。索拉非尼作为一种多靶点激酶抑制剂，已被用于多种恶性肿瘤的治疗；贝伐单抗作为单靶点药物也已被应用于肺癌等的一线治疗方案。本实验通过建立615小鼠宫颈癌细胞株U14移植瘤动物模型，联合使用索拉非尼和贝伐单抗后观察宿主瘤体变化，检测移植瘤组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和 B 细胞淋巴瘤/白血病-2基因相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，Bax）基因的表达，探讨两药协同抗肿瘤的作用，旨在为这种新型生物化疗模式的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和仪器 宫颈癌细胞株U14（中国医学院科学院）；615小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；索拉菲尼片（德国拜耳公司，规格：0.2 g/片，批号：H20110599）；贝伐单抗注射液（上海自罗氏制药有限公司，规格：100 mg/支，浓度 25 mg/ml，批号：S20100068）；生物安全柜（美国 Thermo公司，1300A2）；均质机（法国Bertin公司）；冷冻高速离心机（美国Thermo公司）；ABI StepOnePlus PCR仪（美国Bio-Rad公司）；超低温冰箱（美国Thermo公司）；微量核酸测定仪（美国 Thermo公司，nanodrop）；PCR仪（美国 Bio-Rad公司）；制冰机（日本Panasonic公司，SIM-F140AY65-PC）；移液器（德国 Eppendorf公司，Research）；RNA 提取试剂盒（日本TaKaRa公司，AHF1991D）；RT反转录试剂盒（日本TaKaRa公司，RR036A）；SYBR Green荧光定量PCR染料（日本TaKaRa公司，AK9301）。本实验依托浙江中医药大学动物实验中心完成。

1.2 小鼠荷瘤模型的制备

1.2.1 小鼠宫颈癌细胞株U14复苏 从液氮保存罐中取出装有宫颈癌细胞株U14的冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。将细胞悬液移入离心管，缓慢放入4 ml RPMI1640培养液，离心，弃上清液，用RPMI1640培养液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度为7.5×107/ml，用台盼蓝染色法检测复苏的细胞活性，放置培养箱中备用。

1.2.2 小鼠宫颈癌细胞株U14传代 宫颈癌细胞株U14复苏后，于无菌条件下按每只615小鼠腹腔内注射0.2 ml约1.5×107个活细胞。待7～10 d后，在无菌条件下抽取腹水用于传代或荷瘤。

1.2.3 移植成瘤 将上述抽取的腹水，用0.9%氯化钠溶液稀释后取样用台盼蓝染色镜检，证实为成活瘤细胞并计数，调整细胞浓度为5×107/ml。随即依次在615小鼠右侧腋下于腋中线上约 2 cm处皮下接种0.2 ml约1×107个活细胞。每日观察小鼠及其局部成瘤情况，肿瘤直径≥5 mm时为成瘤。

1.3 实验分组 采用随机数字表法将40只已成瘤小鼠分为空白对照组、索拉非尼组、贝伐单抗组和联合用药组4组，每组10只。索拉非尼组给予索拉非尼溶液4.5 ml/kg（索拉菲尼片200 mg/片溶解于30 ml 0.9%氯化钠溶液，浓度调整至6.67 mg/ml），经小鼠胃管灌入，1次/d，共28 d；贝伐单抗组给予贝伐单抗10 ml/kg（贝伐单抗液浓度稀释至0.5 mg/ml），小鼠左侧腋部皮下注射，1次/d，连用28 d；联合用药组两药的剂量及用法分别同单药组；空白对照组不做任何处理。

1.4 移植瘤体积和重量测定 用药结束后第3天脱臼法处死小鼠，剥离瘤体，测量移植瘤体积（cm3），并用天平秤称重量（g）。

1.5 4组肿瘤细胞VEGF和Bax mRNA表达水平检测采用RT-PCR法。先进行组织的裂解：剪取瘤体组织到均质管中，加入 350 μl裂解 Buffer RL（已加入 50×DTT Solution），均质机上破碎裂解。分别收集4组肿瘤细胞，总RNA提取操作按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书进行。再将提取的RNA置于RT反应液进行反转录反应，条件为37℃ 15 min，85℃5 s，获得cDNA保存于-20°C冰箱备用。选用生工生物工程（上海）有限公司设计并合成的RT-PCR引物序列，PCR反应操作按照TaKaRa荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）进行，将获得的cDNA用RT-PCR仪进行扩增，引物序列见表1。扩增反应条件为：预变性 95°C 3 min；40个循环（95°C 10 s，60 °C 30 s）；溶解曲线：从 55 °C 开始，每 30 s升高0.5°C，直到95°C，循环1次。所有反应信息资料由ABI StepOnePlus PCR仪收集，Ct值通过计算机软件来测量和计算，转录水平通过公式2-ΔΔCt计算。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物对小鼠移植瘤生长的影响 索拉菲尼组、贝伐单抗组移植瘤体积及重量均低于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；索拉菲尼组、贝伐单抗组、空白对照组移植瘤体积及重量均高于联合用药组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 药物对小鼠移植瘤生长的影响

2.2 4组肿瘤细胞VEGF和Bax mRNA表达水平比较索拉菲尼组、贝伐单抗组、联合用药组VEGF mRNA表达水平均低于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；联合用药组VEGF mRNA表达水平均低于索拉菲尼组、贝伐单抗组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。联合用药组Bax mRNA表达水平均高于索拉菲尼组、贝伐单抗组、空白对照组，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 3、图 1-2（插页）。

表3 4组肿瘤细胞VEGF和Bax mRNA表达水平比较

3 讨论

子宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着妇女的健康和生命；子宫颈癌患病率居高不下，并有年轻化的趋势，目前发病率仅次于乳腺癌，已成为临床研究的热点领域之一[4]。目前，手术和放化疗是子宫颈癌的主要治疗手段。对于早期患者，手术治疗是较为有效的治疗方法；对于中、晚期宫颈癌患者，常常因为失去手术机会，进而只能采用放化疗治疗手段。但是传统化疗药物，无论是细胞周期特异性还是非特异性药物，在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤大量的非肿瘤性正常细胞，从而产生一系列毒副反应；放疗则会产生一系列合并症，包括放射线肠炎、放射线膀胱炎及阴道局部挛缩影响性生活等不良反应。因此寻找子宫颈癌更为有效的治疗措施是非常必要的。具有生物靶向特性的药物，在提高疗效的同时减少毒副反应，是近年来国内外研究治疗子宫颈癌尤其是中晚期子宫颈癌、复发性宫颈癌的热点。

血管生成通常发生在发育或伤口愈合期间，当机体产生肿瘤时，血管系统可以通过向肿瘤细胞提供氧气和营养物质从而促进肿瘤发展[5]。VEGF在肿瘤血管生成中起着非常重要的作用,它能够直接促进血管内皮细胞分裂增殖、分化、增生,与肿瘤的生长、浸润和转移有密切关系[6-7]。国内外研究表明宫颈癌组织VEGF表达与淋巴管转移呈正相关，新生淋巴管在肿瘤生长中提供肿瘤生长所需要的营养，加深肿瘤细胞的生物异质性[8-9]。由于VEGF的水平与血管形成及肿瘤生长密切相关，故VEGF可作为肿瘤患者的一个预后参考指标，并指导和监测临床疗效；同时也为应用血管生长抑制剂进行阻断性治疗肿瘤提供理论依据[10]。

索拉非尼在其化学特性上可以有力地抑制迅速加速纤维肉瘤（Raf-1）原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶，并且有较强的激酶选择特性，在体外索拉非尼还表现出对野生型及V599E突变B-Raf活性的抑制作用[11]。于此同时，在新生血管形成及肿瘤进展中，索拉非尼对多种酪氨酸激酶受体有明显抑制作用，包括血管内皮生长因子受体（VEGFR）-2、VEGFR-3、血小板衍化生长因子受体、Fms样酪氨酸激酶3（Flt-3）等。此外，索拉非尼抑制细胞周期蛋白及细胞周期相关蛋白，如细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期素依赖激酶4（cdk4）、细胞周期素依赖激酶 6（cdk6）[12]，使增殖期细胞不能通过“G1-S”调节点，阻滞增殖期细胞在G1期从而阻断细胞周期的进展，进而影响细胞生长促进凋亡[13]。正因为这些作用，索拉菲尼已被FDA批准用于肝癌及肾癌的临床治疗。本研究结果证实索拉菲尼对小鼠宫颈癌细胞株U14移植瘤的VEGF有下调作用。

与索拉非尼具有潜在广谱的抗肿瘤作用相比，贝伐单抗，即重组人抗血管内皮生长因子单克隆抗体,作为单靶点药物，特异性高，可与人类各种VEGF高亲和性结合，阻滞VEGF与受体结合，进而阻断VEGF诱导的血管内皮细胞增殖、迁徙、存活，进而抑制内皮细胞通透性以及一氧化氮、组织因子的产生，抑制肿瘤血管生成[14]，从而有效地抑制肿瘤细胞生长和肿瘤转移。本研究结果证实贝伐单抗对小鼠宫颈癌细胞株U14移植瘤的VEGF有下调作用。

细胞凋亡属细胞主动性死亡，其对肿瘤的发生、发展、治疗和预防都有非常重要的意义[15]，Bax可发挥促细胞凋亡作用。本研究结果提示索拉菲尼联合贝伐单抗对小鼠宫颈癌细胞株U14移植瘤的Bax基因有上调作用，从而促进移植瘤细胞凋亡。

由于肿瘤的生长和转移是多因素、多步骤作用的结果，因此作用于单靶点的药物常常难以明显起效，即使单靶点药物对某一种酶或者受体具有较强的抑制作用，也不一定能够真正地起到治疗疾病的作用；多靶点抗肿瘤药物的结构中含有作用于多个靶点的药效基团，与肿瘤相关的多个靶点产生作用从而产生多种药理活性，进而达到提高疗效和改善安全性的目的[16]。故本课题利用多靶点药物的高灵敏性与单靶点药物的特异性相结合，通过联合用药弥补彼此间的不足，在多个环节上阻断，从而达到理想的治疗效果，本研究结果提示索拉菲尼联合贝伐单抗联合用药对小鼠宫颈癌细胞U14移植瘤具有协同抑制作用。