棘孢木霉菌携带真菌病毒TaUV1的分离与鉴定

张婷婷， 蔡小姚， 滕 丽，3， 周 静， 刘红美*

(1.贵州医科大学 生物与医学工程重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025)

真菌病毒是指可以侵染丝状真菌、酵母和卵菌，并能在其中复制的病毒。在植物病原真菌中存在着大量的真菌病毒[1-3]。大多数情况下，真菌病毒侵染寄主真菌后不会使其出现明显的外部症状，仅有少数真菌病毒侵染寄主后会对其造成影响[4]。此外，研究表明，大多数真菌病毒是双链RNA(dsRNA)病毒。目前，具有dsRNA基因组的真菌病毒在分类学上被分为6个科：呼肠孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、双分病毒科(Paritiviridae)、产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分体病毒科(Quadriviridae)、巨型双节段病毒科(Megabirnaviridae)，以及最近提议的Botybirnaviridae科[5]。但仍存在许多未被分类的真菌病毒。近几年已经报道了诸多未分类的真菌病毒[6-9]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一种自由生活的真菌，常见于土壤和根系生态系统中。其生存能力较强、分布较广且能拮抗植物病原真菌，在农业和工业生产中占有重要的地位。木霉菌具有无污染、对人、动物和环境无毒性、生长速度快、孢子产量高、容易生产等优点，世界各国已将木霉菌应用于农业生产、加工中，成为生物防治、生物肥料和土壤调节剂[10]。中国是农业大国，大型农作物对生物制剂的需求量很大。因此，木霉产业的发展产生了较大的经济效益[11]。木霉菌种(如曲霉菌、哈茨木霉和阿曲韦德菌)是许多土壤传播植物病原体的有效生物防治剂，部分菌种能增强植物生长的能力[12-14]。棘孢木霉(Trichodermaasperellum)是2005年中国记录的木霉属物种[15]，但其开发利用仍处于初步阶段[16-17]。在木霉属物种中，先前已经报道了dsRNA真菌病毒的存在[6,18]。但目前尚无完全测序的真菌病毒感染棘孢木霉菌的报道。在此基础上，笔者侧重于获取棘孢木霉菌株中携带真菌病毒的全基因组序列，并且对其进行基因组解析，从而明确病毒的分类学地位，并将此病毒命名为TrichodermaasperellumUnassigned Virus 1(TaUV1)，以进一步了解真菌病毒的致病性、进化、生命周期以及病毒与寄主真菌之间互作等内容。而且，未分类真菌病毒的发现和新的真菌病毒能丰富病毒分类学，有利于研究真菌病毒的分类和进化，以及促进病毒学的发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 棘孢木霉菌株从贵州省兴仁县交乐村的高砷煤矿土壤中分离得到，长期保存于-80℃。

1.1.2 主要试剂及仪器 DNase I酶、S1 Nuclease酶、M-MLV反转录酶、Klenow酶、pMD18-T载体、T4RNA连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DNA胶回收试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；2×PCR mix购自北京康润诚业生物科技有限公司；DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；恒温培养箱购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；电泳仪购自北京六一公司；凝胶成像仪购自北京君意东方电泳设备有限公司；恒温振荡器购自太仓市实验设备厂；PCR仪购自美国ABI公司。

1.1.3 培养基 PDA培养基：土豆200 g，切片，用去离子水1.4 L煮沸，过滤，量取1 L浸出液，加入葡萄糖20 g，琼脂15 g，121℃恒温高压湿气灭菌20 min。LB培养基：NaCl 10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、琼脂15 g，加蒸馏水定容至1 L，121℃恒温高压湿气灭菌20 min。

1.1.4 引物设计 试验引物由武汉天一辉远公司合成，引物及序列见表1。

1.2 菌株的分离

称取高砷煤矿土壤1 g放入50 mL锥形瓶中，加入适量的去离子水后放入摇床摇匀，取出静置5 min，吸取100 μL上清液稀释5个梯度，每个梯度吸取100 μL液体分别涂布在PDA培养基上，恒温培养箱中28℃培养，待有菌落长出，挑取不同的单菌落接在新的PDA培养基上继续培养，从而分离得到单个菌株。

1.3 病毒RNA的提取与纯化

将目的菌株接种至加有玻璃纸的PDA平板中扩大培养，将菌丝体放入研钵中，用液氮将其研磨成粉末状，取约0.5 g装入2.0 mL无菌离心管中。将0.6 mL 2×GPS、0.6 mL苯酚、0.6 mL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)和138 μL 10% SDS依次加入样品中，室温下充分震荡，12 000 r/min离心10 min。将0.04 g无离子纤维素粉末(CF-11)称入2.0 mL无菌离心管中，取0.6 mL上清液缓慢移入管中，并且每0.6 mL上清液加114 μL无水乙醇，混匀后放置4℃冰箱中过夜。然后离心机12 000 r/min离心5 min后弃上清，倒扣滤纸上吸干残液，移液器加入0.6 mL清洗缓冲液，混匀后静置1 min；重复洗脱3次，加入640 μL 1× STE，混合摇匀，12 000 r/min离心8 min并吸取0.6 mL上清至1.5 mL的无菌离心管，加入60 μL的3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)，0.6 mL的异丙醇(或1.2 mL无水乙醇)，混匀，-20℃下预沉淀2 h，4℃离心机12 000 r/min离心30 min，去除上清液，沉淀用500 μL 75%酒精进行洗脱，4℃下12 000 r/min离心5 min，沥干上清液，并在37℃恒温箱中干燥待其酒精挥发干净，用20 μL DEPC-H2O溶解沉淀，即为粗提的RNA样品。用DNaseI酶和S1核酸酶处理样品，去除样品中的DNA和单链RNA(single-stranded RNA，ssRNA)污染。样品在1%琼脂糖凝胶中电泳，用0.1 μg/mL溴化乙锭染色，紫外下观察RoRV1的条带特征。

1.4 病毒RNA基因组序列的获取

将纯化的dsRNA样品作为模板，采用随机引物扩增法获得RoRV1的中间序列[19]，即将纯化的dsRNA经反转录后用随机引物RACE-3扩增得到大量随机片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈弥散条带，切下750～1 000 bp随机片段进行胶回收，过夜连接pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞中，Amp筛选阳性克隆，挑选单克隆进行PCR鉴定，结果在1%琼脂糖凝胶上呈大小不一的单一片段，挑取较大的随机片段送公司进行测序。病毒末端克隆的方法参考POTGIETER等[20]采用的方法，首先在dsRNA的两末端加上一段已知序列的接头片段，然后将加上接头的dsRNA进行反转录合成cDNA第1条链，最后用与该序列互补的一段寡核苷酸作为引物，另一引物根据已测定序列设计，进行逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)获取dsRNA末端的序列。将扩增的cDNA产物与pMD18-T载体进行连接，并热激转化大肠杆菌DH5α，鉴定阳性克隆，进行测序分析。

1.5 序列拼接及系统进化树建立

序列拼接和开放阅读框(ORF)的预测使用DNAMAN 5.0软件；序列同源性搜索使用NCBI网站的在线BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；蛋白质保守结构域鉴定使用 NCBI网站的保守结构域数据库搜索程序(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?)；氨基酸多序列比对使用 MAFFT软件；系统进化树的构建使用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)。ML树的计算使用 MEGA 5.0软件，采用默认参数设置，并以自展法(bootstraP)对 ML树进行评估，重复抽样次数为1 000。系统进化树分析中所用的病毒如表2所示。选择的25种RNA病毒包括13种Totiviridae科病毒，3种Chrysoviridae科病毒，以及通过BLAST搜索的9种未分类的大型单分子样双链RNA病毒。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

如图1所示，棘孢木霉菌在培养基上培养3 d后会形成同心环状的菌落，且会产生绿色稠密的分生孢子。接近中央的分生孢子呈暗绿色，靠近培养皿边缘的分生孢子由于刚刚形成所以颜色较浅，气生菌丝稀疏，培养基上无色素渗透。

2.2 菌株中真菌病毒的分离与纯化

经DNase I酶和S1核酸酶处理，菌株携带的真菌病毒为dsRNA真菌病毒。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，在10 kb附近可见到1条单一的明显条带(图2)。该病毒命名为TrichodermaasperellumUnassignedVirus 1(TaUV1)。

2.3 TaUV1序列

由图3可见，TaUV1全长9 838个碱基，G+C含量为47.8%。通过随机引物扩增法得到TaUV1的随机片段(图3中1～19)，经序列拼接发现，并不能完全拼接出1条完整的全基因序列。随后，根据已获取的基因组序列设计特异性的搭桥引物A～D和末端引物a～d，通过PCR克隆出未获得的基因组序列，最后通过拼接得到1条完整的TaUV1基因组序列。

2.4 TaUV1基因组序列

如图4所示，从棘孢木霉菌中提取的TrichodermaasperellumUnassignedVirus 1(TaUV1)病毒，已获取GenBank数据库登录号为MG897472。基因组序列分析表明，TaUV1在其基因组正链上包含2个不连续的大的开放阅读框(ORF)，ORF1和ORF2，其具有1个长1 176 bp的 5′-非翻译区(UTR)和1个相对较短的长52 bp的3′-非翻译区(UTR)。ORF1位于1 177～5 686 bp，总长4 509 bp，编码的蛋白有1 502个氨基酸，分子量大小是165.2 kDa。ORF2不与ORF1重叠，位于5 802～9 786 bp，总长3 984 bp，编码的蛋白有1 327个氨基酸，分子量为149.5 kDa。ORF2与ORF1间隔113 bp，在ORF1的终止密码子TAA的5 684～5 686 bp发现了1个潜在的移码序列七聚体(AAAAAAT，5 677～5 683 bp)，在此处发生了程序性-1的核糖体移码机制，使2个ORFS被通读，编码1个融合蛋白。使用RNA Structure软件对病毒TaUV1的-1核糖体移码序列(AAAAAAT)后的113 bp序列进行RNA二级结构的预测分析显示，TaUV1的-1核糖体移码序列(AAAAAAT)后的113 bp序列处有复杂的茎环结构。表明，-1核糖体移码序列(AAAAAAT)后的113 bp序列形成的茎环结构，协助了-1核糖体移码机制的发生，是该移码机制的必须元件之一。

2.5 TaUV1与相关病毒的结构

由表3可见，TaUV1与其他4个病毒的基因组大小均为8.5～10 kb；ORF1编码的蛋白是结构蛋白(structure protein；SP)或假定蛋白(hypothetical protein；HP)，ORF2编码的均为RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases；RdRp)；均有S7结构域(S7 domain)；均有-1核糖体移码现象，同时，也都含有假节或者茎环结构(Pseudoknot or stem-loop structure)。虽在真菌病毒中发现了各种七聚体移码序列，但仅在TaUV1中发现了相同的AAAAAAT七聚体移码序列。

表3 TaUV1与相关病毒的比较

2.6 TaUV1与相关病毒的RdRp区域

如图5所示，在TaUV1和7个病毒的RdRp区域发现了8个RdRp的保守结构域(conserved motifs Ⅰ-Ⅷ)和1个S7结构域。

2.7 系统进化树构建

如图6所示，该系统进化树显示TaUV1与未分类的FvV1、FvV2、TaMV1、MpRV2、FpV2、FpV3、FgV3、SsRV-L和BcRV1聚成一簇，与其他病毒相距较远，这簇病毒为新的未分类病毒科。因此，从TaUV1的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)系统进化的角度证实TaUV1是未分类病毒科的新成员。

3 结论与讨论

通过棘孢木霉菌株携带的真菌病毒TaUV1获取了TaUV1的全基因组信息，从TaUV1基因组结构分析得知，TaUV1具有1条未分段的9 838 bp病毒条带。其具有2个大的不连续的阅读框(ORF)，即ORF1和ORF2。ORF1和ORF2分别编码假定蛋白(HP)和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。2个阅读框之间间隔113 bp，存在1个由七聚体移码序列(AAAAAAT)引起的-1核糖体移码现象，该移码现象的存在将2个大的不连续阅读框融合成1个大的阅读框，提高了病毒的翻译效率。未分段的病毒科中最具有代表性的是Totiviridae科病毒。但Totiviridae科病毒的基因组大小为4.6～6.5 kb。因此，TaUV1并不属于Totiviridae科。

对棘孢木霉菌株JLM45-3所携带的真菌病毒TaUV1构建系统进化树分析得知，TaUV1与未分类的FvV1、FvV2、TaMV1、MpRV2、FpV2、FpV3、FgV3、SsRV-L和BcRV1聚成一簇，属于Unassigned Virus科病毒。Unassigned Virus科病毒的特点：1)具有大的单一未分段病毒基因组；2)编码2个大的阅读框；3)2个阅读框之间存在-1核糖体移码现象，将2个大的阅读框融合成1个阅读框。

研究明确了TaUV1的基因组结构和分类地位，下一步计划获取棘孢木霉菌株的脱毒菌株(TaUV1-)，与未脱毒的菌株(TaUV1+)同时培养，检测两者在生长速度、表型、次级代谢产物的异同，初步了解TaUV1的存在是否对其寄主有影响，以及对TaUV1与棘孢木霉菌株的互作关系进行初步研究。