重金属铅、镉及其互作胁迫下油菜种子萌发差异分析及筛选
2020-09-18张秀侠陈玉琳章洁琼常莉丽
肖 雪，张秀侠，陈玉琳，章洁琼，张 超，常莉丽
(1.贵州师范大学，贵阳 550025；2.贵州省农作物技术推广总站，贵阳 550001)
贵州省矿产资源丰富，土壤中蕴含着较高浓度的Pb、Cd、Hg、As等离子，全省土壤环境污染严重。其中Pb为灰白色质软金属，对人体神经系统、血液血管都有毒害作用；Cd为人体非必须元素，对人体有极大危害。研究发现，曾在日本发生的“痛痛病”与患者体内的Cd含量有关。重金属离子不仅对人体有严重损害，也不利于植物的生长发育，当其浓度超过一定值时，对植物生长有着极大的影响[1]。植物体内的重金属含量超过一定阈值后，将会抑制植物细胞的光合作用和酶活性、并促进细胞内的ATP分解，改变细胞膜的通透性，甚至可干扰植物体内已存在的细胞间及整株水平上的水分及离子稳态平衡，甚至造成植物DNA损伤，最终导致植物生长量、产量及品质的下降[2-5]。高浓度的Cu2+、Na2CO3处理油菜种子，其萌发及根的生长均受到不同程度的抑制[6-7]。Gurpreet等[8]用250 μmol/L的Pb2+溶液处理小麦根尖细胞时发现，小麦根尖细胞核内的核仁变小，并且细胞内出现了肿块状的结构，当Pb的量上升为500 μmol/L后细胞核解体。Hu等[9]用Pb2+溶液处理菹草，发现其叶片细胞核中的核仁分散，染色质凝集，核膜遭到了严重的破坏。
油菜(BrassicanapusL.)是世界上三大油料作物之一，原产于中国，属十字花科芸薹属一年生草本长日照作物，作为重要的种植蔬菜和食用植物油供给作物，其产量和种植面积都居世界首位，在农业经济上也发挥着重要作用[10-12]。油菜生长发育过程中，水分需求量为60%～85%；自身具有强抗寒力，但是抗旱性较差；对土壤要求不及其他作物严格，沙土、粘土、红黄土壤均能正常生长[13]。刘银凤研究表明，干旱胁迫对油菜种子萌发及生长的抑制作用极其明显，直接导致种子不萌发或植株矮小[14]。油菜种子的萌发受诸多因素的影响，为适应目前土壤环境而正常生长发育，筛选能够抗逆境生长的油菜品系尤为重要。
本研究以124份油菜种质为材料，在重金属胁迫下，筛选对铅、镉具有耐性的油菜种质，旨在为油菜育种提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料来源于贵州师范大学生命科学学院，共计124份油菜种质。
1.2 试验方法
1.2.1试验设计
试验采用无水氯化铅和氯化镉配置铅、镉离子溶液，浓度设置为Pb：90 mg/L，Cd：40 mg/L，F(Pb 90+Cd 40)mg/L。4种不同离子配比处理(含ck超纯水)，每重复50粒种子，每处理重复2次。
1.2.2种子萌发试验
挑选大小一致、健康饱满的油菜种子，用浓度为1%的次氯酸钠消毒，蒸馏水清洗3～4次后置于铺有2层滤纸的培养皿(直径为9 cm)中，每皿50粒；将处理后的种子置于人工培养箱中培养(温度：25 ℃，光照：16 h、黑暗：8 h)；24 h后记录种子的萌发数(以胚根突破种皮为标准，记录露白粒数)；每天观察情况，直到种子萌发完全(每天补充适量蒸馏水至第1天刻度线)。
1.2.3种子萌发参数的统计
依据油菜种子萌发特点，借助种子萌发特性分析软件包GERMINATOR[15]中的方法，推算出6个与种子萌发相关指标发芽势、发芽率、发芽指数、T 50、U 7525和AUC，来衡量种子发芽特性。其中：
发芽势(%)=(2 d内正常发芽的种子数/每皿总种子数)×100%；
发芽率(%)=(4 d内正常发芽的种子数/每皿总种子数)×100%；
发芽指数=∑(Gt/Dt)，Dt是发芽日数，Gt为第t天的发芽种子数；
AUC(发芽曲线下面积)：将1～4 d的值连接起来，看覆盖的面积，作为生活力指标；
T 50：发芽率达到50%所需要的时间；
U 7525：发芽率从25%～75%所用的时间。
1.3 数据分析
试验采用Microsoft Excel 2016软件和SPSS 20.0软件进行数据处理和统计分析。运用R 3.6.3统计软件(https://www.R-project.org/)基于离差平方和法(Ward)的聚类分析。
2 结果与分析
2.1 铅、镉及其复合胁迫对油菜萌发的影响
单一和复合胁迫下，发芽势、发芽率、发芽指数和AUC均表现为降低趋势(表1)，说明铅、镉胁迫对油菜的萌发起抑制作用，但抑制程度存在一定差异。在Cd 40 mg/L离子胁迫下，发芽势、发芽率、发芽指数、T 50、U 7525、AUC分别降低0.55%、0.73%、1.21%、2.16 h、3.91 h、1.76%，在Pb 90 mg/L离子胁迫下，发芽势、发芽率、发芽指数、T 50、U 7525、AUC分别降低1.58%、0.93%、1.32%、2.60 h、3.89 h、2.05%，综合说明，Pb 90 mg/L对油菜萌发的抑制作用强于Cd 40 mg/L。复合胁迫时，相比单一胁迫萌发性状参数的变化趋势不尽相同，相比Cd 40 mg/L胁迫，发芽势、AUC、发芽率呈下降趋势，发芽指数呈升高趋势，T 50数值减小，说明所用萌发时间缩短，U 7525数值增大，所用萌发时间增长；相比Pb 90 mg/L单一胁迫，发芽率呈下降趋势，发芽势、发芽指数、AUC呈升高趋势，而T 50所用时间均减少，U 7525所用时间均增加。综上所述，说明单一和复合胁迫都能加快油菜种子的萌发速率，但是并不能促进种子发芽，反而起着抑制作用，总体上，降低了种子活力。
表1 铅、镉及其复合胁迫下油菜萌发参数及影响
表2 无胁迫(ck)油菜萌发参数相关性分析
表3 Cd 40离子胁迫下油菜种子萌发参数相关性分析
表4 Pb 90离子胁迫下油菜种子萌发参数相关性分析
2.2 油菜种子萌发参数相关性分析
由表2～表5可知，胁迫处理前后，6个萌发参数之间均呈极显著或显著相关，其中发芽势、发芽率、发芽指数与T 50呈极显著负相关，与U 7525呈显著负相关，与AUC呈极显著正相关。T 50与U 7525呈显著正相关，与AUC呈极显著负相关，而AUC与U 7525呈显著负相关。但在不同胁迫条件下，相关系数之间存在差异。
表5 复合胁迫下油菜种子萌发参数相关性分析
2.3 油菜铅、镉耐性种质的初步筛选
综合萌发参数对124份油菜种质进行聚类分析，并针对不同类群进行萌发参数方差分析(表6)。
表6 不同离子处理下油菜种质聚类分析和萌发参数方差分析
ck处理下，油菜种质划分为三大类群，类群之间发芽势、发芽率、发芽指数、T 50、U 7525和AUC存在明显差异(图1)。Cd 40 mg/L离子胁迫时，油菜种质划分为三大类群，类群之间发芽势、发芽率、发芽指数、T 50、U 7525和AUC存在差异。其中Cd-Ⅰ群种质对高浓度镉离子响应灵敏，相应的萌发参数相比ck均有提升(图2)。Pb 90 mg/L离子胁迫时，油菜种质划分为三大类群，类群之间发芽势、发芽率、发芽指数、T 50、U 7525和AUC存在差异。其中Pb-Ⅱ群种质对高浓度铅离子响应较灵敏，相应的萌发参数相比ck均有显著提升(图3)。F胁迫时，油菜种质划分为三大类群，类群之间发芽势、发芽率、发芽指数、T 50、U 7525和AUC存在差异。其中F-Ⅰ群种质萌发参数与ck趋于相同，差异较小(图4)。综上所述，说明在不同重金属离子的一定浓度胁迫下，油菜种子对不同重金属离子响应灵敏不一，但总体萌发参数表现良好。
3 讨 论
油菜作为贵州省传统油料大作物,在贵州各地均有种植。宋春然等对贵州全省采集1 014个土壤样品检测分析数据表明[16]，贵州省重金属污染最为严重的是Cd离子污染，其次是Hg离子、Pb离子污染。唐启琳等[17]研究发现，贵州喀斯特区耕地土壤Cd样点超标率分别为90%和22%,非喀斯特区耕地土壤Cd样点超标率分别为30%和12%，土壤环境遭到严重污染，影响了油菜的产量。
3.1 Cd、Pb离子对油菜种子萌发的影响
本研究表明，在Cd、Pb离子单一胁迫及复合胁迫都会使得油菜种子发芽势、发芽率、发芽指数和AUC降低。对重金属逆境响应敏感度不是很高，一般表现为低浓度促进其萌发，反之高浓度则抑制，而随浓度的不断升高，抑制作用逐渐上升。鲁先文和丁时和[18]研究发现，Cd2+单一处理浓度≤5 mg/kg、Pb2+单一处理浓度≤10 mg/kg时，对油菜种子萌发的发芽率、发芽势均为促进作用，高浓度抑制，而当Cd、Pb离子复合处理时，抑制作用更强。纪永[19]研究表明，0.25 mmol/L是Pb2+影响香蒲种子萌发的敏感浓度，3 mmol/L则是Pb2+影响香蒲种子萌发的最大致死浓度。孙杰等研究发现，Pb离子对油菜种子萌发影响不大，但对油菜苗的生长发育起着强抑制作用[20]。
3.2 基于萌发参数对油菜铅、镉耐性种子选育
为降低油菜种子萌发遗传差异，筛选适合贵州高浓度Cd、Pb离子生长的油菜种质。基于6个萌发参数，将124份油菜种子聚类分析，群体间方差分析揭示：ck胁迫时，油菜ck-Ⅰ群体115份具有较高的发芽指数，T 50和U 7525数值较小，表明该群体种质高发芽率和较一致的发芽整齐度；Cd 40 mg/L离子胁迫时，油菜Cd-Ⅰ群体94份具有较高的发芽指数和较一致的发芽整齐度；Pb 90 mg/L离子胁迫时，油菜Pb-Ⅱ群体67份具有较高的发芽指数和较一致的发芽整齐度；F处理时，油菜F-Ⅰ群体111份具有较高的发芽指数和较一致的发芽整齐度。由此可筛选油菜ck-Ⅰ、Cd-Ⅰ、Pb-Ⅱ和F-Ⅰ群体为本次研究的推荐群体。
