茉莉酸甲酯诱导邻近番茄植株抗斜纹夜蛾的浓度和距离效应

宋 佳,王 骏,叶 茂,*

1 贵州大学昆虫研究所,贵阳 550025 2 贵州山地农业病虫害重点实验室,贵阳 550025

植物在与植食性昆虫协同进化的过程中逐渐形成了多种防御机制,植物一方面可以产生单宁,酚酸,生物碱和蛋白酶抑制剂等直接抑制昆虫的生长发育[1],另一方面植物释放挥发性物质吸引捕食性天敌或寄生性天敌,从而对植食性昆虫进行间接防御[2]。此外,已有很多研究证实植物间存在信息交流,植物在受到植食性昆虫的取食后所释放挥发性化合物,如4-异丁基苯乙酮,柠檬烯,月桂烯,罗勒烯,MeJA和水杨酸甲酯等诱导激活邻近植株防御反应[3-4],这种植物与植物之间通过挥发性化合物进行信息交流的过程称为“植物间通讯”[5],目前已报道有16科35种植物可以进行化学通讯[6]。在这些虫害诱导的挥发物中,MeJA和水杨酸甲酯与植物间通讯密切相关,这两种化合物挥发性强,可通过植物的气孔进入植物体内,在细胞质中被酯酶水解为茉莉酸或水杨酸,从而诱导邻近植物产生诱导防御反应[7-8]。Farmer和Ran[9]发现,被修剪的山艾树可释放MeJA诱导邻近健康的番茄植株产生蛋白酶抑制剂抑制昆虫的取食,而Karban通过田间试验也证明山艾树受到损伤后会释放出大量MeJA,诱导邻近未受伤的番茄和野生的烟草植株合成大量蛋白酶抑制剂和多酚氧化酶,而未受伤植株受昆虫的取食明显减少[10]。植物释放的挥发物不仅可以诱导邻近植物的防御,同时会影响昆虫的行为[11],促使昆虫转移到邻近其他未受危害的植株上取食[12],即昆虫可以利用外部信号寻觅合适的取食环境或发现潜在的危险而逃离[6,11,13],因而认为邻近受害植株不一定是“好邻居”[14],如果植物受伤后释放的挥发物对邻近植株防御的诱导作用有浓度效应和距离的限制,那么对于固着生长的植物来说,通过释放挥发物来激活邻近植株的防御反应存在一定生态风险[15]。

斜纹夜蛾(SpodopteralituraFabricius)是一种世界性分布的广食性害虫,对农业生产造成极大的危害。番茄(Lycopersiconesculentum)是一种重要的蔬菜作物,并且番茄全基因组已经被测序,是研究植物与昆虫相互作用的经典模式植物。本实验以番茄和斜纹夜蛾为实验材料,研究植物间重要通讯信号物质MeJA诱导邻近番茄植株抗虫性的浓度和距离效应,实验结果对利用植物间通讯物质防治害虫有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

(1)斜纹夜蛾：供试昆虫为人工饲料在实验室中饲养10代以上的敏感品系。温度(25±2)℃,相对湿度60% RH,光周期14 L∶10 D。

(2)番茄：供试品种为合作903大红番茄,以营养钵单株培育于无虫网室,移栽20 d后,挑选生长发育整齐一致的健康番茄植株供试。生长期间不施用任何农药。

(3)MeJA：(±)-methyl jasmonate购自美国Sigma-aldrich公司,纯度为98%。

1.2 实验处理

MeJA用少量无水乙醇溶解后,再用蒸馏水配制成浓度分别为1 mmol/L和10 mmol/L的溶液(含2%无水乙醇),以2%的无水乙醇水溶液为对照。在不同狭长大棚(1m ×1 m × 4 m)内按离气味源60 cm、120 cm、180 cm、240 cm和300 cm的距离摆放番茄植株,每个距离摆放6株番茄植株,作为6个重复。在大棚空气进口处分别喷雾不同浓度的MeJA和对照水溶液60 mL作为气味源,不同浓度的MeJA在不同大棚中进行。喷雾MeJA后立即封闭大棚处理48 h后,检测不同距离番茄植株叶片过氧化物酶(Peroxidase, POD),多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)和脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)的酶活性,并检测斜纹夜蛾取食各处理番茄植株叶片后的体重增长率。

1.3 实验方法

1.3.1番茄植株抗虫酶活性的测定

(1)POD,PPO酶活性检测方法

称取番茄叶片0.1 g,液氮研磨成粉末,在液氮未挥发完前转入离心管,加入1 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH=7.2)(内含5%聚乙烯吡咯烷酮PVPP),在涡旋振荡仪上涡旋振荡10 s,低温冷冻离心机中12000 r/min离心15 min,上清液为酶液,POD活性测定采用愈创木酚法进行[16],PPO活性测定采用邻苯二酚法[17],酶活性最终以每毫克蛋白所含有的酶活单位(U min-1mg-1蛋白质)表示。

(2)LOX检测方法

称取0.1 g叶片,液氮研磨成粉末,在液氮未挥发完前转入离心管,立即加入1 mL 0.05 mol/L Tris-HCL提取液,在涡旋振荡仪上涡旋振荡10 s,低温冷冻离心机中12000 r/min离心15 min,上清液为待测酶液,以亚油酸为底物测定LOX活性[18],酶活性最终以每毫克蛋白所含有的酶活单位(U min-1mg-1蛋白质)表示。

1.3.2蛋白含量测定

蛋白含量测定采用Bradford方法[19],使用牛血清蛋白作为标准蛋白。

1.3.3检测斜纹夜蛾体重增长率

喷雾不同浓度MeJA后立即封闭大棚,诱导处理48 h后,挑选生长发育一致的4龄斜纹夜蛾幼虫,分别接到60 cm 和300 cm处的番茄植株叶片上取食,每株番茄苗接3头幼虫,每个处理10株番茄,即每个处理共30个重复。取食2 d、4 d和6 d 后用万分之一天平称量斜纹夜蛾的体重,计算体重增长率。

1.4 数据处理及统计方法

数据分析在Statistica中进行,用Duncan多重比较法分析(P<0.05)处理间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 MeJA对邻近番茄植株叶片PPO酶活性的影响

离气味源不同距离的对照组番茄植株其叶片PPO活性没有显著差异,而1 mmol/L 和 10 mmol/L MeJA处理48 h后,离气味源不同距离的番茄植株叶片PPO活性呈现不同程度的变化(图1)。1 mmol/L MeJA 处理下,以离气味源60 cm处番茄植株叶片的酶活性最高,并随着距离的增加有逐渐减弱的趋势,其中60 cm和120 cm处的番茄植株其叶片PPO活性分别比相同距离的对照组高84.60%和48.65%,10 mmol/L MeJA处理下,以离气味源240 cm和300 cm处番茄植株叶片的酶活性最高,其中180 cm、240 cm和300 cm处的番茄植株其叶片PPO活性分别比相同距离的对照组高69.06%,122.50%和110.61%。双因素方差分析结果表明,MeJA处理浓度和距离间交互效应显著(P=0.000363),以10 mmol/L MeJA处理下离气味源300 cm处番茄植株叶片的PPO活性的的诱导效应最强。

图1 MeJA对邻近番茄植株叶片多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性的影响

2.2 MeJA对邻近番茄植株叶片POD活性的影响

对照组中不同距离番茄植株其叶片POD活性没有显著差异(图2)。1 mmol/L MeJA 处理下,60 cm、180 cm和240 cm处的番茄植株其叶片POD活性分别比相同距离的对照组高260.60%,120.16% 和142.67%,而120 cm和300 cm番茄植株其叶片POD活性与对照组相比没有显著差异；10 mmol/L MeJA处理下,60 cm、120 cm、180 cm和240 cm处的番茄植株其叶片POD活性显著比对照组的高309.76%,331.20%,146.72% 和134.11%,而300 cm处番茄植株叶片POD活性与对照组相比没有显著差异。双因素方差分析结果表明,MeJA处理浓度和距离的交互效应显著(P=0.000266),以10 mmol/L MeJA处理下离气味源60 cm处番茄植株叶片的POD活性最强,随着距离的增加而呈现逐渐减弱的趋势。

图2 MeJA挥发物对邻近番茄植株叶片过氧化物酶(Peroxidase, POD)活性的影响

2.3 MeJA对邻近番茄植株叶片LOX酶活性的影响

对照组不同距离番茄植株间叶片LOX酶活性没有显著差异(图3)。1 mmol/L MeJA 处理下,60 cm和180 cm处的番茄植株其叶片LOX活性显著比相同距离的对照组的高182.23%,107.81%,而120 cm、240 cm和300 cm番茄植株其叶片LOX活性与对照组相比没有显著差异；10 mmol/L MeJA处理下,60 cm、120 cm和180 cm的番茄植株其叶片LOX活性显著比对照组的高431.73%,133.41%,115.18%,而240 cm和300 cm处的番茄植株叶片LOX活性与对照组相比没有显著差异。双因素方差分析结果表明,MeJA处理浓度和距离的交互效应显著(P=0.0000),以10 mmol/L MeJA处理下离气味源60 cm处番茄植株叶片的LOX活性最强,随着距离的增加而呈现逐渐减弱的趋势。

图3 MeJA对邻近番茄植株叶片脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)活性的影响

2.4 MeJA对邻近番茄植株抗斜纹夜蛾的影响

研究结果表明1 mmol/L和10 mmol/L MeJA挥发物都显著诱导提高了邻近番茄植株对斜纹夜蛾幼虫的抗性,其中取食1 mmol/L MeJA 处理组60 cm处的番茄植株叶片的斜纹夜蛾幼虫,其取食4 d和6 d后的体重增长率显著比取食相同距离下对照组番茄植株叶片的低58.62%和37.78%,比取食300 cm处的番茄植株叶片的斜纹夜蛾幼虫低47.35%和23.67%(图4)；此外,取食10 mmol/L MeJA 处理组60 cm处的番茄植株叶片的斜纹夜蛾幼虫,其取食4 d和6 d后的体重增长率显著比取食相同距离下对照组番茄植株的低74.57%和54.91%,比取食300 cm处的番茄植株叶片的斜纹夜蛾幼虫低16.46%和25.03%。双因素方差分析结果表明,相同取食时间下,MeJA处理浓度和距离的交互效应显著(P=0.0000),以10 mmol/L MeJA挥发物的诱导作用最强,且随着距离的增加,番茄植株的抗虫性明显降低。

图4 斜纹夜蛾幼虫体重增长率变化

3 讨论

生物间的化学通讯是一个普遍的自然现象,并一直受科学家们的关注[5,10,20]。植物与授粉昆虫,植物与真菌,植物与害虫,植物与害虫的天敌之间都存在化学通讯[21]。近年来,大量研究发现,植物在受到植食性昆虫的攻击后释放出的大量挥发性化合物,诱导增强邻近植株的抗虫性,在这些挥发性化合物中,MeJA参与了植物间的信息交流,与植物间的防御通讯密切相关[10,21-23]。本实验以喷雾 MeJA 模拟番茄植株间的通讯信号,研究其作为植物间通讯信号诱导邻近植株抗虫性的距离和浓度效应。

POD是植物防御的关键酶之一,对维持植物体内自由基平衡具有重要作用,能利用过氧化氢氧化供氢体,并参与合成木质素,影响植物的感病或抗病[24]。方海涛用0.01 mmol/L、0.1 mmol/L和1.0 mmol/L 3种浓度的MeJA处理均使蒙古扁桃叶片POD 活性较对照增加,再用天幕毛虫(MalacosomaneustriatestaceaMotsch)取食诱导后的蒙古扁桃木叶片,均降低了对叶片的消化率、转化率和利用率[25]。LOX是一种非血红素铁蛋白,是植物抗胁迫响应的关键酶[26]。LOX基因的表达或LOX酶活性的高低都与植物的防御状态密切相关,LOX2基因的高表达在油菜对菌核病抗性中起重要作用,参与了茉莉酸介导的菌核病抗性防御反应[27]。

本实验研究结果表明喷雾1 mmol/L 和10 mmol/L MeJA产生的挥发物可以显著诱导增强邻近番茄植株叶片PPO,LOX和POD的活性,以10 mmol/L MeJA处理组植株叶片防御酶LOX和POD酶的活性最高,1 mmol/L MeJA处理组植株叶片酶活性次之,并且随着距离的增加而呈现减弱的趋势,表明MeJA挥发物对邻近番茄植株的诱导抗性有明显的浓度效应和距离效应。PPO是植物体内的一种抗营养酶类,能催化酚类化合物转化为醌,减少食草昆虫对植物营养的获取[28],高浓度MeJA对PPO的活性有抑制作用[29],本研究发现1 mmol/L和10 mmol/L MeJA均能诱导番茄叶片PPO活性,1 mmol/L MeJA处理组植株叶片PPO酶的活性随着距离的增加而呈现减弱的趋势,而10 mmol/L MeJA处理下,PPO酶的活性随着距离的增加而增强,也表明高浓度MeJA对PPO酶活性有抑制作用；斜纹夜蛾幼虫体重增长率实验结果表明斜纹夜蛾幼虫取食不同距离番茄叶片后,其体重增长率都显著低于对照组斜纹夜蛾,相同时间段下均以取食10 mmol/L MeJA 处理的60 cm处番茄植株叶片的幼虫体重增长率最低,而取食对照组不同距离间番茄植株叶片的斜纹夜蛾幼虫,相同时间段下其体重增长率没有明显差异,这些结果说明MeJA挥发物对邻近植株抗虫性的诱导有距离效应,这种距离上的限制应该是由MeJA的浓度逐渐降低引起的。

植食性昆虫取食诱导的植物挥发物,如一些绿叶挥发物、萜类化合物等,除了可以吸引害虫的天敌外,还可以作为植物与植物间“交流”的信号物质,诱导相邻植物产生防御反应[30]。例如,预先用顺式-3-己烯基乙酸酯cis-3-hexenyl acetate(z3HAC)熏蒸过的杂交杨树苗叶片再被舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫取食时,叶片中茉莉酸和亚麻酸含量更高。此外,z3HAC 使得一些调控茉莉酸防御信号的基因处于防御警备状态,一旦昆虫取食后这些基因迅速进行高表达[31],这种通过某些生物或者非生物因子刺激警备后诱导植物产生更加快速和强烈的防御反应,即称为防御诱发或防御警备(defense priming),是一种特殊的植物诱导防御策略[32]。胡永建等研究发现虫害诱导马尾松邻枝的MeJA和萜烯类化合物含量升高[33]。茉莉酸类物质浸种处理或直接喷施处理可以诱发植物防御,如研究发现预先用MeJA喷施处理的水稻植株,机械损伤时,水稻胰蛋白酶抑制剂合成基因OsBBPI和过氧化物酶基因OsPOX迅速表达,并发现 MeJA 通过调控OsBBPI启动子区组蛋白修饰来诱发水稻防御[34]。此外,植物被激发诱导获得的抗性可能具有遗传特性[35]。在拟南芥中,与未受激发诱导的植物相比,受到病原物侵染诱导的植物的后代其防御相关基因显著表达,植株抗性增强[36]。本实验结果表明MeJA作为植株间的重要防御通讯信号,可以诱发增强邻近番茄植株抗虫酶活性,抑制斜纹夜蛾的取食,并且这种诱导作用有显著的距离和浓度效应,随着距离的增加和MeJA浓度的降低而呈现减弱的趋势,然而,MeJA诱发邻近不同距离间植株防御反应的时间效应及诱发的分子机制还有待深入研究。