人工接种副干酪乳杆菌生产L-乳酸酸菜条件的研究

刘晓辉，陈顺，李杨，敖静，高晓梅，孙玉禄

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

酸菜是我国北方的传统发酵蔬菜制品，采用当地大白菜发酵而成，其清爽可口、鲜香嫩脆、解腻开胃的品质吸引着国内外广大的消费者[1,2]。但普通酸菜中的乳酸基本是D-乳酸。由于人体只有代谢 L-乳酸的L-乳酸脱氢酶[3]，D-乳酸在体内积累能引起代谢紊乱甚至导致中毒,对人体有害。世界卫生组织(WHO)提倡在食品及医药行业中使用 L-乳酸取代D-乳酸，还明确规定，人体每天摄取D-乳酸的量限制在100 mg/kg体重以下。副干酪乳杆菌是一种益生菌[4]，不但可以产生L-乳酸，而且能够耐受有机体的防御机制，如口腔中的酶、胃液中胃酸和小肠的胆汁酸等。副干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，调节肠内菌群平衡，促进人体消化吸收。同时，副干酪乳杆菌对其宿主营养、免疫、防病等具有显著的益生功效。基于以上原因，本试验采用可以产L-乳酸的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)作为生产菌种，通过本试验研究出最佳生产条件，为L-乳酸酸菜的工厂化生产提供了理论基础。由于纯种发酵的L-乳酸酸菜亚硝酸盐浓度一直很低，所以此试验没有将亚硝酸盐含量作为检测指标[5-9]，只将乳酸菌菌数、L-乳酸含量和Vc含量作为检测指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

白菜：购于超市。

1.1.2 试剂

柠檬酸铵、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钾、亚铁氰化钾、乙酸、盐酸萘乙二胺、硼砂、对氨基苯磺酸、浓盐酸、乙酸锌(均为分析纯)：天津市风船化学试剂科技有限公司；D/L-乳酸检测试剂盒：爱尔兰Megazyme公司，购于赛恩斯(北京)仪器有限公司。

1.1.3 仪器

SHP-150恒温培养箱 上海精宏设备有限公司；SX-500型全自动高温高压灭菌锅 TDMY KOGYO公司；722S分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司；SA-900-1JZ超净工作台 上海一恒科技有限公司；JA2103N电子天平 上海精密科学仪器有限公司；小号缸；各种玻璃仪器等。

1.1.4 菌种

乳酸菌菌种：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)本实验室冰箱4 ℃保藏。

1.1.5 培养基配制

MRS培养基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，乙酸钠5 g，柠檬酸三铵2 g，吐温80 1 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，水1000 mL，pH自然。分装到500 mL三角瓶中，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

将冰箱4 ℃保藏的菌种接入上述培养基中，放置培养箱中32 ℃培养24 h，传种2代，镜检无杂菌备用。

1.2.2 酸菜中Vc含量检测[10-12]

采用GB 5009.86-2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》中的2,6-二氯靛酚滴定法。

1.2.2.1 样品处理

称取切碎的酸菜样品20.00 g，放在研钵中加2%草酸溶液少许研碎，倒入200 mL容量瓶中，加2%草酸溶液至刻度，用离心机离心沉淀后过滤备用。

1.2.2.2 样品测定

吸取10.0 mL滤液于烧杯中，用2,6-二氯靛酚钠盐溶液滴定至桃红色20 s不褪色，记下染料的用量。吸取2%草酸溶液，用染料作空白滴定记下用量。

1.2.2.3 结果计算

按照GB 5009.86-2016的计算公式。

1.2.3 L-乳酸含量检测[13,14]

按照D/L-乳酸检测试剂盒执行。

表1 L-乳酸检测步骤Table 1 The detection procedure of L-lactic acid

1.2.3.1 样品处理

酸菜汁离心，必要时进行稀释，使L-乳酸浓度到0.003～0.30 g/L之间；温育到25 ℃备用。

1.2.3.2 样品测定

按照表1步骤检测。

1.2.3.3 结果计算

式中：C为L-乳酸浓度(g/L)，V为最终体积(mL)，MW为L-乳酸的分子量(g/mol)，ε为NADH在340 nm处的消光系数=6300(1/mol×cm)，d为光路(cm)，v为样品体积(mL)。

如果样品在制备阶段已经稀释，结果必须乘以稀释系数F。

1.2.4 乳酸菌计数[15,16]

按照GB 4789.35—2016执行。

1.2.5 发酵条件[17,18]

1.2.5.1 不同发酵温度对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响

将白菜除烂叶后，用清水冲洗，将白菜摆放在缸中，每缸放10 kg,压实，加2%温度为40 ℃的盐水刚好超过白菜，加入5%液体副干酪乳杆菌菌种，封口，分别在25，28，32，35，37，39 ℃发酵12 d，检测乳酸菌菌数、L-乳酸含量和Vc含量。

1.2.5.2 不同食盐浓度对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响

将白菜除烂叶后，用清水冲洗，将白菜摆放在缸中，每缸放10 kg,压实，分别加1%、2%、4%、6%、8%、10%温度为40 ℃的盐水刚好超过白菜，加入5%液体副干酪乳杆菌菌种，封口，32 ℃发酵12 d，检测乳酸菌菌数、L-乳酸含量和Vc含量。

1.2.5.3 不同接菌量对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响

将白菜除烂叶后，用清水冲洗，将白菜摆放在缸中，每缸放10 kg,压实，加2%温度为40 ℃的盐水刚好超过白菜，分别加入1%、3%、5%、7%、9%的液体副干酪乳杆菌菌种，封口，32 ℃发酵12 d，检测乳酸菌菌数、L-乳酸含量和Vc含量。

1.2.5.4 不同发酵时间对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响

将白菜除烂叶后，用清水冲洗，将白菜摆放在缸中，每缸放10 kg,压实，加2%温度为40 ℃的盐水刚好超过白菜，加入5%的液体副干酪乳杆菌菌种，,封口，32 ℃发酵，发酵时间为3，6，9，12，15 d。在蔬菜汁pH值达到3.5时检测乳酸菌菌数、L-乳酸含量和Vc含量。

1.2.5.5 不同初始水温对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响

将白菜除烂叶后，用清水冲洗，将白菜摆放在缸中，每缸放10 kg,压实，加2%温度为55，50，45，40，35，30，25 ℃和自来水的盐水刚好超过白菜，加入5%的液体副干酪乳杆菌菌种，封口，32 ℃发酵12 d，检测乳酸菌菌数、L-乳酸含量和Vc含量。

2 结果与分析

2.1 不同发酵温度对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响

图1 温度对Vc和L-乳酸的影响Fig.1 The effect of temperature on Vc and L-lactic acid

由图1可知，发酵温度为32 ℃时乳酸菌菌数和L-乳酸含量最高，随发酵温度升高，乳酸菌菌数和L-乳酸含量都有所下降，这是因为温度过高不适应此副干酪乳杆菌生长，同时影响L-乳酸的产量。随发酵温度升高，Vc含量减少，这与Vc不耐高温有关，在32 ℃时Vc含量降低相对少，故确定酸菜最佳发酵温度为32 ℃。

2.2 不同食盐浓度对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响[19]

图2 食盐浓度对Vc和L-乳酸的影响Fig.2 The effect of salt content on Vc and L-lactic acid

由图2可知，食盐浓度为4%时乳酸菌菌数和L-乳酸含量最高，但此时Vc含量相对低，在食盐浓度为2%时Vc含量相对高，乳酸菌菌数和L-乳酸含量与食盐浓度为4%时相差不大，再加之提倡低盐健康饮食，最佳酸菜发酵食盐浓度选择2%。由图2还可知，食盐浓度过高，L-乳酸含量随之降低，是因为过高的食盐抑制了乳酸菌的生长，从而降低了L-乳酸含量，食盐浓度高也会加快Vc含量降低。

2.3 不同接菌量对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响[20]

图3 接菌量对Vc和L-乳酸的影响Fig.3 The effect of inoculation amount on Vc and L-lactic acid

由图3可知，在接菌量为5%时乳酸菌菌数、L-乳酸和Vc含量均为最高，接菌量为1%和3%时、由于接菌量低发酵较慢，乳酸菌菌数和L-乳酸含量低，L-乳酸对Vc有一定的保护作用，在低浓度的L-乳酸环境中Vc含量下降快，接菌量为7%和9%时，由于接菌量过大、营养缺乏抑制了乳酸菌生长繁殖，乳酸菌菌数和L-乳酸含量较低，缺少L-乳酸的保护、Vc含量也有所下降，由此确定酸菜最佳接菌量为5%。

2.4 不同起始水温对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响

图4 起始水温对Vc和L-乳酸的影响Fig.4 The effect of initial water temperature on Vc and L-lactic acid

由图4可知，不同起始水温对乳酸菌菌数和L-乳酸的产生速度有较大影响，初始水温太高，菌种受到抑制使菌数少，产酸慢，当初始水温在45 ℃的乳酸菌菌数最高，产酸最快，这是因为45 ℃的水加入白菜中，整体温度在32 ℃左右，最适合此菌种发酵，随着初始水温的降低，发酵速度随之降低，菌数和L-乳酸含量也会减少。初始水温高会大大降低Vc含量，随着初始水温降低，Vc含量降低速度减慢。初始水温45 ℃时菌数和L-乳酸含量高，但Vc含量低，在初始水温40 ℃时的菌数和L-乳酸含量与初始水温45 ℃的含量差别不大，这时Vc含量降低较少，所以初始水温选择40 ℃。

2.5 不同发酵时间对酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌数、L-乳酸含量的影响

图5 发酵时间对Vc和L-乳酸的影响Fig.5 The effect of fermentation time on Vc and L-lactic acid

由图5可知，酸菜最佳发酵时间为12 d，在发酵第12天时乳酸菌菌数和L-乳酸含量最高，L-乳酸含量达到最高值31.35 mg/kg，随时间增加，L-乳酸含量变化不大，这是由于达到一定酸度对乳酸菌有一定抑制作用，基本停止发酵，L-乳酸含量不变，又因为酸度过强杀死少量乳酸菌，乳酸菌菌数略有下降。由图5还可知，Vc含量随发酵时间增加而降低，在第12天时Vc含量为16.58 mg/100 g，相对原料白菜Vc含量为19.24 mg/100 g下降不大，故确定酸菜最佳发酵时间为12 d。

3 结论

人工接种副干酪乳杆菌发酵酸菜试验表明最适发酵条件为：发酵温度32 ℃、食盐浓度2%、接种量5%、初始水温40 ℃、发酵时间12 d，在该条件下成品酸菜中乳酸菌菌数对数值为12 CFU/mL,L-乳酸含量为31.35 mg/kg，Vc含量为16.58 mg/100 g。