针刺对慢性温和刺激大鼠粪便代谢的影响*

徐雪娇，李天英，汤思乔，王慧丽，王瑜萌欣，王瑞琪，徐英凯，何秀丽

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

抑郁症的治疗一直是全球范围关注的热点[1]。针刺在抑郁症的治疗中有着显著的优势，但其机制不明[2-3]。随着“微生物-肠-脑”轴理论的兴起，其在神经精神疾病的研究领域热度不断增加[4]。肠道中存在着庞大的微生物群落，这些微生物依附于肠道生存，其代谢产物在人体中也起到至关重要的作用。本实验研究针刺3周中对抑郁大鼠粪便代谢的调节，并找寻变化一致代谢物的所在通路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

购于哈尔滨光大动物养殖中心。品系：SD大鼠。性别：雄性。数量：30只。实验室温度保持在24℃左右，正常昼夜节律。

1.2 设备与试剂

GC-MS平台(Agilent，7890A/5975C);冷冻离心机 (美国Thermo) ;-80℃冰箱(青岛海尔);移液器(德国Eppendorf)，漩涡混匀器(型号：QL-901，其林贝尔仪器公司);甲醇(德国CNW公司,批号：Q4891440);L-2-氯-苯丙氨酸(上海恒创生物科技,批号：1080094)。

1.3 总流程

图1所示，适应性喂养1周后进行糖水基线测定。将大鼠分为刺激大鼠24只、空白大鼠(Control组)6只。然后将刺激大鼠均分为4组：CUMS组、CUMS+1W组、CUMS+2W组和CUMS+3W组。开始针刺，1周后CUMS+1W组取材，2周后CUMS+2W组取材，3周后CUMS+3W组和CUMS组取材。

图1 总流程图

1.4 动物模型

刺激方式包括：减小居住空间、异物、异味、敌人入侵和干扰睡眠等[5]。两天内不重复使用同种刺激。

1.5 糖水消耗

给予大鼠两瓶外观完全一致的纯水和糖水。实验全程为24 h，在中途将两瓶水交换位置。计算糖水消耗的比例。

1.6 针刺方法

鼠板固定后对针具(吴江市云龙医疗器械有限公司)进行酒精消毒清理。本实验选取百会(位于头部正中，两耳中点)和四神聪(百会旁开1寸)，平刺进针4～6 mm，20 min后拔针[6]。

1.7 取材方法

水合氯醛(10%)麻醉后取盲肠内容物到冻存管中并储存于-80℃冰箱。

1.8 GC-MS

选用美国安捷伦公司GC-MS仪器。具体为[7-8]:30 mg粪便、20 μL L-2-氯-苯丙氨酸溶液与600 μL甲醇加入到离心管中;超低温冰箱放置后进行研磨，超声进行提取后低温静置，离心后取上清。质控样品与检测样品采用同样的处理模式。样品分析模式：不分流进入检测系统(样品量：1 μL)。质谱进样条件：280℃，6.0 mL/min。连续随机样本分析模式。离子源和四极杆分别为230℃、150℃。升温步骤由60℃至310℃。

1.9 统计方法

1.9.1 行为学 应用SPSS 23.0进行糖水消耗数据统计，根据数据的分布情况，采用t检验或非参数检验。P<0.01具有显著性差异。

1.9.2 GC-MS数据分析 首先对原始数据进行整理(ChromaTOF软件)，将假阳性数据清除后获得样品信息。响应强度峰面积归一化后将数据导入软件(SIMCA-P+14.0软件)。整合数据后先评价样本总体趋势：无监督分析(PCA)。再对组间差异物质进行鉴别：有监督分析方法((O)PLS-DA)。进一步对模型进行验证采用7次交互验证和200次检验。

2 结果

2.1 针刺治疗对CUMS大鼠糖水消耗的影响

如图2所示，第4周刺激大鼠的SPT数值显著低于空白大鼠(P<0.01)。在针刺治疗的过程中，大鼠的糖水消耗呈上升趋势，直到治疗3周后，针刺大鼠糖水消耗恢复。见表1。

表1 各组糖水消耗值

注：与control组相比，**P<0.01。图2 糖水消耗实验

2.2 针刺改变CUMS大鼠粪便代谢水平

如图3所示，本研究选取针刺治疗过程中3个时间点和CUMS大鼠的粪便。PCA分析不能区分4组。OPLS-DA尚能将4组区分。排列验证得出该模型可靠。差异代谢物中23种在CUMS+3W组和CUMS组中差异有统计学意义，并且在治疗的3周中一直处于升高或降低的变化趋势。见表2。

2.3 关键代谢途径

针刺过程中始终保持升高或降低的差异代谢物参与的代谢通路：①甘、苏和丝氨酸的代谢;②氨酰基的合成;③磷酸肌醇代谢和;④半胱氨酸和蛋氨酸的代谢。代谢通路和影响值如图4～5。

图3 代谢平台分析

表2 4组粪便差异代谢物

图4 影响值(impact factor≥0.1)

3 讨论

全世界约有15%的人口正遭受着抑郁症的困扰，而且发病率仍呈上升趋势[9-10]。尽管人们不断的努力，但抗抑郁药物带来的副作用仍然无法避免。百会和四神聪位于头部，是临床上治疗抑郁症的常用穴位[11-14]。头部为人体阳经交汇之处，称为“诸阳之会”，通过针刺头部穴位能够起到平衡阴阳之效，百会为督脉之穴，在抑郁症的治疗中起到了不可替代的作用。临床上还可根据辨证论治选择配穴，从而达到整体治疗的目的。实验全过程采用糖水消耗进行评价，判断模型是否成功以及针刺治疗效果。本研究中针刺提高了CUMS大鼠糖水消耗值，逆转了欣快感缺乏的抑郁样行为，进一步证实针刺在抑郁症治疗中的作用。

随着“微生物-肠-脑”轴这一概念的逐步深入，肠道微生物的相关研究在神经精神疾病的领域日益增多[15]。作为与人类共生的微生物，其代谢对人体的影响不可忽视。本研究选取经典模型对其进行针刺治疗，取针刺治疗1周、2周、3周和CUMS组大鼠盲肠内容物，探讨代谢的改变及其参与的途径。23个差异代谢物在CUMS+3W组和CUMS组之间存在显著差异，并且在治疗过程中保持始终升高或者降低的趋势。参与以下代谢：甘、苏和丝氨酸的代谢(L-丝氨酸，L-苏氨酸)，氨酰基合成(L-丝氨酸，L-蛋氨酸，L-苏氨酸，L-脯氨酸)，半胱氨酸和蛋氨酸的代谢(L-丝氨酸，L-蛋氨酸)和磷酸肌醇代谢(肌醇)。以上结果提示针刺治疗过程中主要是通过调节肠道内容物的氨基酸代谢和肌醇代谢发挥作用。丝氨酸为非必须氨基酸，能够对脂肪酸的代谢起调节作用。有研究表明，外源性L-丝氨酸可能是通过调节大脑丝氨酸代谢相关的不同机制而发挥抗抑郁样作用[16]。ACTH诱发的抑郁大鼠模型苏氨酸异常，可能在抑郁症的氨基酸代谢过程中发挥重要作用[17]。在抑郁样行为发展过程的监测研究中发现L-苏氨酸、丝氨酸和氧化脯氨酸等氨基酸在抑郁症的形成过程中存在一致的变化[18]。有研究表明，重度抑郁症患者海马和前额叶的肌醇水平异常[19]。本研究证实针刺调节CUMS大鼠肠道内容物的肌醇水平，提示针刺治疗可能通过调节肠-脑轴的代谢发挥作用。

本实验证实了针刺对CUMS大鼠的肠道内容物代谢具有调节作用，找到粪便关键代谢通路。同时笔者发现所调节的代谢物在抑郁症的发生发展中都起到关键的作用，进一步说明针刺治疗的重要性。本课题组正在进行同时间点粪便多样性的检测，预计将结果与本研究结果进行联合分析，补充针刺对“微生物-肠-脑”轴调节的相关数据。