针刀疗法配合独活寄生汤对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症的干预效果

洪 刚,王 丹

(重庆开州区人民医院,重庆 405400)

近年来，腰椎间盘突出症发病率受年龄及职业因素的影响而日渐升高，其病程长，主要表现为局部腰痛及下肢放射性疼痛，严重影响患者生活质量[1]。神经机械压迫、炎症刺激、血供障碍等是腰椎间盘突出症主要发病机制，针刀疗法对腰椎间盘突出症患者疗效确切，可利用锋利刀刃对软组织损伤处条索、硬结、粘连等进行切割、剥离，恢复关节处力学平衡，同时结合了毫针针刺疏通损伤组织气血，达到治疗效果[2],而独活寄生汤具有镇痛、抗炎、改善血液循环等功效，也已逐步应用于腰椎间盘突出症的治疗中[3]，但有关两者联合应用的报道尚不多见，因此本研究旨在探究针刀疗法与独活寄生汤联合应用治疗腰椎间盘突出症大鼠的效果，分析其对背根神经节炎症的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

70只清洁级健康SD大鼠，雄性，8周龄，体质量200～250 g，购于广东省医学实验动物中心，合格证号：2001A046，大鼠常规饲养，室温25℃左右，自由进水、进食。

1.2 主要试剂

独活寄生汤(购于中国人民解放军第202医院药局，药方组成：独活12 g，秦艽、杜仲、桑寄生、牛膝、细辛各9 g，防风、干地黄、当归、茯苓、川芎、肉桂心、芍药、人参各6 g，甘草3 g)；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(金斯瑞生物科技有限公司)；碘伏消毒剂(北京百诺威生物科技有限公司)等。

1.3 主要仪器

9号腰椎穿刺针(上海埃斯医械塑料制品有限公司)；一次性无菌HZ系列汉章针刀(北京卓越华友医疗器械有限公司，0.4 mm×0.4 mm)；PL-200型热痛测试仪(四川科仪诚科技有限公司)；5810R型低温离心机(德国Eppendorf公司)；JY-SCZ2180型垂直电泳槽(西安赛维斯生物科技有限公司)；NOVA型超薄切片机(瑞典LKB公司)；CX23型光学显微镜(日本Olympus公司)；Q550图像处理系统(德国LEICA公司)。

1.4 动物模型构建及分组

将70只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、独活寄生汤组、针刀组、针刀联合独活寄生汤组，各14只。除假手术组外，其余各组大鼠均构建腰椎间盘突出症大鼠模型[4]：术前1 d，于大鼠背部脱毛，以3.5 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，距鼠尾根部1 cm处切断鼠尾，切开尾部椎间盘见髓核呈胶冻样(约10 mg)，取5个髓核，1 mg髓核加1 μL生理盐水，混匀制备自体髓核混悬液,大鼠取屈曲侧卧位，以9号腰椎穿刺针于L4～5棘突间隙行硬膜外穿刺，注射20 μL自体髓核混悬液，于硬膜外腔注射30 μL 2%利多卡因；假手术组以20 μL生理盐水替代大鼠自体髓核混悬液，其他操作均同上。待大鼠清醒后若双前肢活动自如，双后肢运动、感觉丧失或减退，30 min左右完全恢复即证明硬膜外穿刺成功，继续观察，若大鼠双后肢无瘫痪，且两侧后足热痛反应出现痛觉过敏即证明模型制备成功。

1.5 各组动物干预方法

1.5.1 独活寄生汤组 建模3 d后开始灌胃独活寄生汤13.8 mg/kg，1次/d，连续灌胃2周；

1.5.2 针刀组 建模3 d后进行针刀疗法：将大鼠以自制袜套固定于鼠板上，于L4～5棘间、L4～5棘间旁开0.1 cm处、患椎上下横突及双侧坐骨神经出口处以碘伏消毒，进行针刀操作，均以HZ系列一次性针刀进行针刀操作，①棘间：针刀刀口线方向与脊柱纵向轴方向一致，按四部规程刺入，待针刀有落空感(突破黄韧带时)微提针刀，稍加推进；②横突点：针刀刀口线方向与脊柱纵向轴方向一致，按四部规程刺入，松解完横突后将针刀退至浅层，倾斜针刀从外到内，由浅层向深层松解至横突根部，待有落空感时将针刀刀口线微调为“八字形”，向里稍加推进；③坐骨神经出口处：针刀刀口方向与坐骨神经走向一致，按四部规程刺入，待针刀有落空感时微提针刀然后稍加推进，均以碘伏消毒，进行针刀操作，以大鼠下肢触电样抽动为度，3次/周，治疗2周。

1.5.3 针刀联合独活寄生汤组 建模3 d后同时给予独活寄生汤灌胃并施以针刀疗法，方法同独活寄生汤组及针刀组。

1.5.4 模型组及假手术组 建模后正常饲养。

1.6 大鼠热痛刺激缩爪阈值

分别于干预前及干预2周后将各组大鼠置于PL-200型热痛测试仪的检测盒内，加工热光源通过仪器辐射到检测盒底部玻璃板上并使其聚集至大鼠一侧足底后半部分，光斑直径5 mm，记录从开始照射至缩爪时间间隔，左右足交替测试3次，2次测试间隔5 min，取平均值[5]。

1.7 HE染色

观察大鼠背根神经节组织病理变化,干预2周后待检测大鼠热痛刺激缩抓阈值结束后，将大鼠固定于铡刀，端头处死，迅速倒置，腹腔解剖，暴露并采集长约2 mm的L5神经根组织，于10%甲醛中固定24 h，常规制备厚约4 μm石蜡组织切片，进行HE染色，于光学显微镜下观察大鼠背根神经节病理形态[6]。

1.8 ELISA法检测大鼠背根神经节组织炎性因子含量

背根神经节组织采样同1.7，研磨、匀浆，并以生理盐水按1:10比例进行稀释制备组织悬液，以ELISA法检测背根神经节组织中白细胞介素1(IL-1)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量[7]。

1.9 WB法检测大鼠背根神经节组织炎性因子含量

背根神经节组织采样同1.7，提取组织总蛋白，经BCA法定量，取50 μg进行WB检测，以β-actin为内参，经Q550图像分析软件统计IL-1、TNF-α蛋白表达[8]。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠热痛刺激缩爪阈值比较

模型组干预前及干预2周后热痛刺激缩爪阈值均较假手术组缩短(P<0.05)；与模型组及干预前比较，干预2周后独活寄生汤组、针刀组及针刀联合独活寄生汤组大鼠热痛刺激缩爪阈值均延长，且针刀联合独活寄生汤组长于独活寄生汤组、针刀组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠热痛刺激缩爪阈值比较

2.2 各组大鼠背根神经节病理学形态观察

HE染色显示，假手术组小鼠背根神经节组织细胞排列整齐，胞核位于中央，大且圆，核仁清晰，胞质内充满颗粒样尼氏小体；模型组细胞间隙距离增加，胞核固缩或偏移，胞质溶解，呈空泡样变，尼氏小体减少；独活寄生汤组、针刀组及针刀联合独活寄生汤组上述病理变化均有不同程度的减轻。见图1。

注：A.假手术组; B.模型组; C.独活寄生汤组; D.针刀组; E.针刀联合独活寄生汤组。图1 HE染色观察大鼠背根神经节病理损伤(200×)

2.3 ELISA法检测各组大鼠背根神经节炎性因子含量

ELISA检测显示，模型组大鼠背根神经节组织IL-1、TNF-α含量较假手术组显著升高，而独活寄生汤组、针刀组及针刀联合独活寄生汤组较模型组显著降低，且针刀联合独活寄生汤组显著低于独活寄生汤组及针刀组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠背根神经节组织IL-1及TNF-α含量比较

2.4 WB法检测各组大鼠背根神经节炎性因子含量

WB检测显示，模型组大鼠背根神经节组织IL-1、TNF-α蛋白相对表达量较假手术组显著升高，而独活寄生汤组、针刀组及针刀联合独活寄生汤组较模型组显著降低，且针刀联合独活寄生汤组显著低于独活寄生汤组及针刀组(P<0.05)。见图2、表3。

注:A.假手术组; B.模型组; C.独活寄生汤组; D.针刀组; E.针刀联合独活寄生汤组。图2 WB法检测大鼠背根神经节组织IL-1及TNF-α蛋白含量(200×)

表3 各组大鼠背根神经节组织IL-1及TNF-α蛋白相对表达量比较

3 讨论

腰椎间盘突出症主要是由纤维环、髓核产生退行性变，纤维环破裂，髓核脱出，导致相邻脊神经根受刺激或压迫所致[9-10]。其属于中医“痹症”范畴，风、寒、湿、虚是其致病因素，而机体内在的正虚是其发病的关键。独活寄生汤最早记载于《备急千金要方》，主治风寒湿痹，全方共奏祛风湿、止痹痛、益肝肾及补气血之功，邪正兼顾，驱邪不伤正，扶正不留邪[10-11]。独活寄生汤可有效调控腰椎间盘突出症大鼠髓核组织及纤维环组织中MMP-1表达，抑制腰椎间盘退变，效果显著；针刀疗法整合了针刺疗法及手术松解法，其利用“针刺”原理，疏通经脉、行气活血，并结合西医“刀”的原理，松解粘连组织，解除挤压，实现“以松致通、通则不痛”，可通过调节腰椎间盘突出症大鼠背根神经节组织致痛因子表达，改善其局部微循环，进而达到治疗目的[12-14]。目前有关针刀疗法结合独活寄生汤共同治疗腰椎间盘突出的效果尚未见报道，因此本研究以腰椎间盘突出大鼠模型为研究对象，进行初步探究。

腰椎间盘组织是机体最大的无血供组织，髓核因包裹于纤维环内而与血液循环隔离，当退行性病变或外伤导致椎间盘抗原与血液循环接触后，诱导免疫应答，释放炎性介质，诱发炎性病变，导致疼痛。针刀具有比普通毫针更强的针刺效应及针感，刺激穴位及经络后可行气活血、通经止痛；同时还可刮除瘢痕，松解组织粘连，有利于吸收炎性介质，消散炎性渗出，消除肌肉痉挛，恢复病变部位平衡，通利关节并改善关节功能。针刀疗法能够通过松解局部粘连改善腰椎间盘突出症根性神经痛大鼠微循环、促进炎症因子代谢、缓解疼痛；而独活寄生汤可抑制炎性因子生成， 减轻髓核所致炎性反应，治疗肝肾亏虚型腰椎间盘突出[15-16]。髓核脱出后可引发神经根与背根神经节形态、功能变化，脊神经根微循环与营养障碍是腰椎间盘突出症的主要致痛机制[17]。本研究结果显示，独活寄生汤组、针刀组及针刀联合独活寄生汤组大鼠背根神经节病理损伤均较模型组有所改善。提示针刀联合独活寄生汤可有效改善腰椎间盘突出症大鼠背根神经节病理损伤；此外本研究结果显示，干预2周后独活寄生汤组、针刀组及针刀联合独活寄生汤组大鼠热痛刺激缩爪阈值均较模型组延长，且针刀联合独活寄生汤组长于独活寄生汤组及针刀组；此外，独活寄生汤组、针刀组及针刀联合独活寄生汤组大鼠背根神经节组织IL-1、TNF-α含量及其蛋白相对表达量较模型组显著降低，且针刀联合独活寄生汤组显著低于独活寄生汤组及针刀组。提示针刀疗法配合独活寄生汤可有效降低腰椎间盘突出症大鼠背根神经节组织炎性细胞因子含量，有效缓解其炎性损伤，缓解疼痛。

综上，针刀疗法配合独活寄生汤可有效降低腰椎间盘突出症大鼠背根神经节组织炎性因子含量，改善其组织病变，进而明显提高大鼠热痛刺激缩爪阈值，减轻疼痛，具有明显的协同效应，治疗效果显著，但有关其具体分子作用机制及独活寄生汤的最佳应用剂量尚需进一步系统研究。