针刺百会穴对慢性不可预见性温和应激大鼠糖水消耗和脑代谢组学的影响*

徐雪娇，范文栋，齐子棠，张 悦，谢 璐，何秀丽，李天英

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

抑郁症已经成为严重影响人类健康的疾病之一，到2020年抑郁症将成为世界第二大疾病[1-3]。它不仅给患者带来极大的痛苦，还给家庭和社会带来沉重的负担。其治疗越来越受到人们的重视，传统西药治疗副作用大，且易出现耐药性。针刺治疗抑郁症具有疗效好、副作用小的优势[4 -5],其治疗机制尚不清楚。在众多的抑郁动物模型中，慢性不可预见性温和应激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)大鼠模型在抑郁症的研究中颇为常见[6-7]。本实验选用百会穴，观察针刺治疗抑郁大鼠对糖水消耗的影响，并运用GC-MS(gas chromotography/mass spectrometry)代谢组学平台，探究针刺治疗抑郁症对中枢代谢水平的影响，挖掘相关代谢通路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

黑龙江中医药大学实验动物中心购入18只雄性SD大鼠。喂养1周后开始适应2%蔗糖水溶液。饲养条件：标准啮齿动物食水，温度21～23℃，湿度45%～55%，光照周期12 h。

1.2 实验流程

如图1，大鼠适应2%蔗糖水溶液5周后随机分成CUMS大鼠(12只)和对照组大鼠(6只)，放在不同房间。CUMS大鼠开始进行慢性不可预见性温和刺激，对照组大鼠不予任何刺激。4周刺激结束后随机平均分为CUMS组和CUMS+针刺组，随后CUMS+针刺组开始针刺治疗。糖水消耗实验(Sucrose preference test,SPT)每周固定时间进行。

图1 实验流程图

1.3 CUMS流程

采用经典的CUMS造模方法[8]。具体方法合笼(4～6 h)、空笼(8～12 h)、倾斜鼠笼45°(4～12 h)、湿笼(6～8 h)、夜间光照(12 h)和频闪(12 h)等方法，每日给予1～2种刺激且相邻两天刺激方法不重复。

1.4 行为学

糖水消耗实验(SPT)测量24 h内2%蔗糖水溶液消耗的百分比。糖水瓶和纯水瓶的位置在第12 h交换。

1.5 针刺干预

参考已发表文献[9]。华佗牌针具(0.18 mm×13 mm，苏州医药有限公司制造)，上午9点，针刺百会穴(GV20，两耳尖连线中点),消毒后进针5 mm，留针20 min，连续针刺3周。

1.6 取材

7%水合氯醛麻醉大鼠后断头取脑，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.7 GC-MS检测与分析

GC-MS检测和分析方法基于本研究组已发表的文章[10-11]。

1.7.1 样品制备 取30 mg样本加入到1.5 mL离心管中，加入20 μL甲醇配置的0.3 mg/mL内标(L-2-氯-苯丙氨酸)。于-80℃冰箱中放置2 min后研磨(60 Hz，2 min)，超声提取10 min。-20℃静置30 min后低温离心15 min(13 000 rpm，4℃)，取400 μL的上清液，装入玻璃衍生瓶中。

1.7.2 色谱条件 气相色谱质谱联用仪选用Agilent公司的7890A-5975C(Agilent,USA)。衍生化之后采用不分流的方式注入样品，进样量1 μL。经毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Folsom,CA,USA)(HP-5MS)分离后进行质谱检测。高纯度氦气作为载气(6.0 mL/min)。升温程序：60℃→125℃→190℃→210℃→310℃。

1.7.3 质谱条件 离子源温度：230℃。四极杆温度：150℃。电子能量：70 eV。全扫描模式(SCAN)范围：50～600 m/z。

1.8 数据分析

1.8.1 行为学数据统计分析 使用统计软件SPSS 23.0，采用Studentt检验、非参数Mann-WhitneyU检验。当P<0.05被认为差异具有统计学意义。

1.8.2 代谢组学数据分析 ChromaTOF(v 4.34,LECO,St Joseph,MI)软件预处理原始数据，导出的数据矩阵可获得样品的基本信息、代谢物名称、质谱响应强度和内标峰。其中假阳性峰已经除去并去除冗余与峰合并。归一化质谱峰的响应强度后得到数据矩阵，将其导入SIMCA-P+14.0、Umetrics、Umea、Sweden软件包。无监督的主成分分析(PCA)用于评估总体分布和稳定性，有监督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA用来找到组间差异代谢物。循环交互验证(7次)和排序检验(200次)用于评价模型是否存在过度拟合。

2 结果

2.1 针刺百会穴对CUMS大鼠SPT的影响

4周慢性不可预见性温和刺激后，CUMS大鼠糖水消耗显著低于对照组大鼠(P<0.01)。针刺治疗结束后，针刺大鼠与对照组大鼠糖水消耗差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：与对照组比较,**P<0.01。图2 糖水消耗

2.2 针刺百会穴对CUMS大鼠脑代谢组学影响

图3为对照组、CUMS组、CUMS+针刺组总离子流图。如图4所示，PCA分析得出3组之间能够区分。OPLS-DA分析能够将3组明显区分，表明3组间存在显著的代谢差异。R2X、R2Y和Q2均是大于零，说明OPLS-DA模型是可靠的。在排列检验中，R2与Q2值明显大于置换的R2与Q2，证明不存在过拟合。OPLS-DA载荷图鉴定出81种差异代谢物。分析结果表明针刺百会穴治疗CUMS大鼠3周后，脑组织中L-同型半胱氨酸和甲氧苄氨嘧啶发生了逆转。见表1。

图3 3组总离子流图

图4 代谢组学分析

表1 3组脑差异代谢物(对照组与CUMS组具有差异的代谢物)

2.3 代谢通路分析

使用KEGG和HMDB寻找2种逆转的脑差异代谢物的潜在代谢途径。MetaboAnalyst 3.0用来确定潜在途径的影响值。结果显示，逆转的差异代谢物主要参与以下两个代谢途径：①半胱氨酸、蛋氨酸代谢;②嘧啶代谢。见图5。代谢途径如图6所示。

图5 使用MetaboAnalyst 3.0进行逆转代谢物的代谢途径分析

图6 针刺治疗CUMS大鼠逆转代谢物(划线)参与的代谢途径

3 讨论

寻找有效的治疗方法是抑郁症亟待解决的问题。针刺作为传统治疗手段，在抑郁症的治疗中突显优势，其治疗效果显著，除疼痛外无明显副作用[12-14]。有望取代传统抗抑郁药物而成为抑郁症治疗的主要手段。百会穴为督脉上的重要穴位，临床应用十分广泛，在抑郁症的治疗上起到了十分有效的作用[15-16]。糖水消耗作为评价抑郁症行为学中的金标准，其在抑郁症的研究中是不可缺少的[17-18]。在抑郁症的临床研究中，脑组织的取材十分困难，本研究采用经典的抑郁症动物模型——慢性不可预见性温和应激大鼠，观察针刺百会穴治疗抑郁症对糖水消耗和脑代谢水平的影响。从行为学到中枢代谢探究针刺治疗抑郁症的理论依据。

经过4周的刺激，CUMS大鼠的糖水消耗值显著下降，说明模型成功。3周的针刺治疗后，CUMS+针刺大鼠的糖水消耗值恢复到正常水平，说明针刺对抑郁样行为具有逆转作用。本研究基于GC-MS代谢组学平台，对CUMS组、CUMS+针刺组和对照组大鼠的脑组织进行检测分析，结果显示经过3周针刺治疗，CUMS大鼠脑中L-同型半胱氨酸和甲氧苄氨嘧啶水平发生逆转。氨基酸和嘧啶的代谢紊乱在神经精神疾病中较为常见。同型半胱氨酸是一种在蛋氨酸代谢过程中产生的十分重要的氨基酸。若同型半胱氨酸不转化为蛋氨酸或半胱氨酸则可以引起神经毒性[19]。Chung等研究表明台湾地区青少年中抑郁焦虑发病率增高与其血清中半胱氨酸代谢紊乱有关[20]。有研究表明，抑郁症伴自杀意念合并运动障碍的患者，其同型半胱氨酸的调节大都出现异常[21]。在抑郁症嘧啶代谢紊乱的相关研究中，本课题组的前期研究结果显示，双相情感障碍患者(抑郁相)尿液中尿嘧啶的代谢紊乱[10]。代谢通路分析结果显示L-同型半胱氨酸和甲氧苄氨嘧啶主要参与半胱氨酸、蛋氨酸代谢和嘧啶代谢。以上结果提示，针刺治疗抑郁症可能是通过调节以上代谢通路完成的。

综上所述，针刺能够逆转抑郁样行为并调节脑代谢，为针刺治疗抑郁症提供中枢水平的理论依据。下一步，笔者将在针刺治疗过程中采集多个时间点数据，研究针刺治疗抑郁症过程中对代谢的调节,为针刺治疗抑郁症代谢水平提供更加全面的数据,为针刺成为抑郁症的主要治疗手段提供理论依据。