不同提取工艺翅果油抗氧化能力与活性成分的分析

张 忠，王呈馨，范柳萍，李 娟

(1.山西医科大学 人体解剖教研室，太原 030001; 2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122; 3.山西琪尔康翅果生物制品有限公司，山西 临汾 041000)

翅果油树(ElaeagnusmollisDiels)是一种落叶乔木，属胡颓子科、胡颓子属，属于国家二级濒危保护植物[1]。翅果油树主要分布在山西省的翼城、平陆和乡宁等地，在陕西省也有零星分布[2]。翅果油中不饱和脂肪酸、VE、植物甾醇等营养成分含量丰富，具有抗氧化、降血脂等多种生理功能。陈雨娜[3]以昆明种小鼠为研究模型，发现翅果油可显著提高小鼠血清及肝脏组织的抗氧化能力和血脂调节能力。黄玲等[4]发现翅果油在Wistar雄性大鼠体内的抗氧化作用显著强于同等剂量的纯VE，也强于沙棘油。翅果油的抗氧化功能与其脂肪酸组成、有益伴随物密切相关。国外有较多对不同植物油中有益微量伴随物含量与抗氧化能力关系的报道。Antónia等[5]分析了橄榄果渣中VE、脂肪酸组成以及总酚含量，并对其抗氧化能力进行初步研究，结果表明羟基酪醇、α-生育酚和多不饱和脂肪酸都是橄榄果渣中重要的抗氧化基础物质。Behvar等[6]采用GC-MS检测了薄荷精油中的各种有益伴随物含量，并采用6种不同的方法检测其抗氧化能力，结果表明薄荷精油具有强的自由基清除能力、金属离子螯合能力和铁离子还原力，可作为高效的抗氧化剂。

目前，翅果油的研究主要集中在翅果油的营养成分、制备工艺以及降血脂、抗炎、抗疲劳等功能方面，缺乏翅果油不同制油方法、不同细分部分的抗氧化活性以及抗氧化活性的基础物质的研究，为此本文深入分析了5种不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分的抗氧化能力，并通过相关性分析初步研究了翅果油抗氧化能力与翅果油中生物活性成分含量之间的关系，明确其抗氧化活性的主要基础物质，以期为功能性翅果油的高质量开发提供详实的数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

翅果油树种子，由山西琪尔康翅果生物制品有限公司提供。无水乙醇、氢氧化钾等，均为分析纯。角鲨烯标准品、VE标准品、甾醇标准品、维生素E水溶性类似物(Trolox)，均购于Sigma公司。

N-20多功能氮吹仪，CP214电子分析天平，CS-700Y型摇摆粉碎机，SC-30超级恒温槽，CZR091型榨油机，SFE 500超临界萃取设备，HPLC 2414液相色谱分析仪，GC-9A气相色谱分析仪。

1.2 试验方法

1.2.1 翅果油的不同提取工艺

按以下5种工艺提取翅果油，之后将翅果油置于4℃冰箱中保存，用于生物活性成分和抗氧化活性的检测。

1.2.1.1 超临界CO2流体萃取法

将翅果油树种子粉碎至80目，根据前期试验[7]，称取120 g翅果油树种子粉置于萃取釜中，在萃取压力30 MPa、萃取温度50℃、萃取时间150 min的条件下进行超临界CO2流体萃取，获得翅果油。

1.2.1.2 有机溶剂提取法

将翅果油树种子粉碎至40目，取翅果油树种子粉，参照前期试验[7]和GB 5009.6—2016中的索氏提取法提取翅果油。以无水乙醚为提取溶剂，提取条件为料液比1∶10、提取温度65℃、回流时间4 h，蒸干溶剂后得到翅果油。

1.2.1.3 直压冷榨法

根据前期试验[7]，称取适量的翅果油树种子，装入滤袋置于榨油机中，在60 MPa下压榨，收集得到翅果油。

1.2.1.4 直压热榨法

参考谭传波等[8]提取山茶油的热榨工艺，适当调整后用于提取翅果油。称取适量的翅果油树种子于托盘中，在130℃鼓风式烘箱中烘烤30 min，趁热装入滤袋置于榨油机中，在60 MPa下压榨，收集得到翅果油。

1.2.1.5 红外热榨法

根据前期试验[7]，称取适量的翅果油树种子于托盘中，在150℃远红外烘箱中烘干1 h，趁热装入滤袋置于榨油机中，在60 MPa下压榨，收集得到翅果油。

1.2.2 抗氧化活性的测定

参考刘国艳[9]的方法处理翅果油，分别制备翅果油的极性部分和非极性部分。

DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、Fe3+还原能力(吸光度)的测定及计算参照徐鑫等[10]的方法。

羟基自由基清除率的测定及计算参照张志英[11]的方法。

1.2.3 翅果油中生物活性成分的测定

1.2.3.1 甾醇含量的测定

以5α-胆甾烷醇为内标，采用GC-MS测定翅果油中的甾醇含量[12]。KOH-乙醇溶液处理油样后用正己烷萃取，定容后进行GC-MS分析。检测条件： DB-5弹性石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm×0.25 μm)，载气流速 1.0 mL/min，分流比100∶1，进样量1.0 μL，离子化模式EI，分子离子碎片扫描范围(m/z)50～650。

1.2.3.2 VE含量的测定

用色谱纯正己烷超声溶解翅果油后，采用高效液相色谱分析测定VE含量。色谱条件：Luna Silica色谱柱(150 mm×4.6 mm×3 μm)，流动相为正己烷-异丙醇(体积比99∶1)，检测波长290 nm。

1.2.3.3 角鲨烯含量的测定

参照张东生等[13]的方法测定翅果油的角鲨烯含量。KOH-乙醇溶液处理油样后用正己烷萃取，定容后进行GC分析。色谱条件： Rtx-1弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，FID检测器温度300℃，进样口温度250℃，分流比100∶1。

2 结果与分析

2.1 翅果油的抗氧化能力

2.1.1 翅果油DPPH自由基清除能力的比较

不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对DPPH自由基的清除率如图1所示。

注：冷榨、有机、SFE、红外和热榨分别对应直压冷榨法、有机溶剂提取法、超临界CO2流体萃取法、红外热榨法和直压热榨法。下同。图1 不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对DPPH自由基的清除率

由图1可见，随着样品质量浓度的增加，DPPH自由基清除率也逐渐增加。在全油中，除直压热榨法外，其余4种提取工艺制得的翅果油质量浓度为40 mg/mL时，DPPH自由基清除率已达90%。在翅果油极性部分中，除超临界CO2流体萃取法外，其余4种提取工艺在质量浓度为12 mg/mL时，DPPH自由基清除率已达90%。在翅果油非极性部分中，5种提取工艺在质量浓度为50 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到49%以上，且具有良好的线性关系。

根据DPPH自由基清除率的变化趋势，比较5种提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分在同一质量浓度(20.0 mg/mL)下DPPH自由基的清除能力，结果如图2所示。

图2 不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对DPPH自由基的的清除能力

由图2可见：在全油中，有机溶剂提取法制得的翅果油DPPH自由基清除能力最强，为678.95 μmolTE/100 g；直压热榨法制得的翅果油DPPH自由基清除能力最弱，为245.22 μmolTE/100 g。在翅果油极性部分中，红外热榨法的DPPH自由基清除能力最强，为1 080.35 μmolTE/100 g；超临界CO2流体萃取法的DPPH自由基清除能力最弱，为756.16 μmolTE/100 g。在翅果油非极性部分中，有机溶剂提取法的DPPH自由基清除能力最强，为130.81 μmolTE/100 g；直压热榨法的DPPH自由基清除能力最弱，为56.05 μmolTE/100 g。

2.1.2 翅果油羟基自由基清除能力的比较

不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对羟基自由基的清除率如图3所示。

图3 不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对羟基自由基的清除率

由图3可见，翅果油全油及其极性、非极性部分的羟基自由基清除率均随着样品质量浓度的增加逐渐升高。在同一质量浓度下，5种提取工艺制得的翅果油全油及其极性和非极性部分的羟基自由基清除率相近。在全油中，当翅果油质量浓度为1～4 mg/mL时，除直压冷榨法外，其他4种提取工艺下样品质量浓度与羟基自由基清除率具有良好的线性关系。5种提取工艺制得的翅果油极性部分在3.5 mg/mL时，羟基自由基清除率均达90%。5种提取工艺制得的翅果油非极性部分在3.0 mg/mL时，羟基自由基清除率均达90%。

在同一质量浓度(2.0 mg/mL)下比较不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分的羟基自由基清除能力，结果如图4所示。由图4可见：在全油中，直压冷榨法对羟基自由基的清除能力最强，为22 194.14 μmolTE/100 g；直压热榨法对羟基自由基的清除能力最弱，为11 723.36 μmolTE/100 g。在翅果油极性、非极性部分中，直压冷榨法对羟基自由基的清除能力最强，分别为38 272.82、32 220.76 μmolTE/100 g。

图4 不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对羟基自由基的清除能力

2.1.3 翅果油ABTS自由基清除能力的比较

不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对ABTS自由基的清除率如图5所示。

图5 不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对ABTS自由基的清除率

由图5可见，不同提取工艺得到的翅果油对ABTS自由基的清除率均随着翅果油质量浓度的增大逐渐增加。在全油中，有机溶剂提取法制得的翅果油在质量浓度为50 mg/mL时，对ABTS自由基清除效果最好，清除率可达90%以上。在翅果油极性部分中，当质量浓度为32 mg/mL时，除超临界CO2流体萃取法和直压热榨法外，其余3种提取工艺制得的翅果油的极性部分对ABTS自由基清除率均达90%以上。在翅果油非极性部分中，在10～50 mg/mL 的质量浓度范围内，有机溶剂提取法的ABTS自由基清除率最高，50 mg/mL时为55%，远高于直压热榨法的。

在同一质量浓度(2.0 mg/mL)下比较不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分的ABTS自由基清除能力，结果如图6所示。

图6 不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分对ABTS自由基的清除能力

由图6可见：在全油中，有机溶剂提取法的翅果油对ABTS自由基的清除能力最强，为1 032.02 μmolTE/100 g，超临界CO2流体萃取法的对ABTS自由基的清除能力最弱，为459.47 μmolTE/100 g；在翅果油非极性部分中，有机溶剂提取法的对ABTS自由基的清除能力最强，为525.37 μmolTE/100 g，直压热榨法的对ABTS自由基的清除能力最弱，为96.94 μmolTE/100 g；在翅果油极性部分中，有机溶剂提取法的对ABTS自由基的清除能力最强，为2 000.76 μmolTE/100 g，超临界CO2流体萃取法的对ABTS自由基的清除能力最弱，为636.50 μmolTE/100 g。

2.1.4 翅果油Fe3+还原能力的比较

不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分的Fe3+还原能力(吸光度)如图7所示。

图7 不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分的Fe3+还原能力(吸光度)

由图7可见，在全油中，当5种提取工艺制得的翅果油质量浓度在60～100 mg/mL范围内时，有机溶剂提取法制得的翅果油Fe3+还原能力最强。在翅果油极性部分中，当质量浓度在8～40 mg/mL范围内时，红外热榨法制得的翅果油Fe3+还原能力最强。在翅果油非极性部分中，当质量浓度在20～50 mg/mL范围内，有机溶剂提取法制得的翅果油Fe3+还原能力最强。

在同一质量浓度(20.0 mg/mL)下，比较不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分的Fe3+还原能力，结果如图8所示。

图8 不同提取工艺制得的翅果油全油及其极性、非极性部分的Fe3+还原能力

由图8可见：在全油中，有机溶剂提取法制得的翅果油Fe3+还原能力最强，达937.66 μmolTE/100 g，直压冷榨法制得的翅果油Fe3+还原能力最弱，为281.57 μmolTE/100 g；在翅果油非极性部分中，有机溶剂提取法的Fe3+还原能力最强，为313.06 μmolTE/100 g，红外热榨法的Fe3+还原能力最弱，为119.35 μmolTE/100 g；在翅果油极性部分中，红外热榨法的Fe3+还原能力最强，为2 771.89 μmolTE/100 g，超临界流体CO2萃取法的Fe3+还原能力最弱，为780.47 μmolTE/100 g。在同一质量浓度下(20.0 mg/mL)，直压冷榨法和超临界CO2流体萃取法制得的翅果油非极性部分的Fe3+还原能力相近，但直压冷榨法制得翅果油极性部分的Fe3+还原能力强于超临界CO2流体萃取法制得翅果油极性部分。而全油部分中，超临界CO2流体萃取法的Fe3+还原能力远高于直压冷榨法，说明与直压冷榨法相比，超临界CO2流体萃取法更有利于提高翅果油中非极性部分的抗氧化能力。

2.2 不同提取工艺制得的翅果油中生物活性成分的比较(见表1)

由表1可见：有机溶剂提取法的翅果油中VE含量最高，达到110.73 mg/100 g，超临界CO2流体萃取法的次之；有机溶剂提取法和超临界CO2流体萃取法的翅果油中总甾醇含量显著高于直压冷榨法、直压热榨法和红外热榨法(p<0.05)，直压热榨法结果与Dabrowski等[14]的研究结论相同。这可能是由于热榨前处理温度过高引起翅果油中甾醇发生降解，对翅果油中总甾醇含量有较大影响[15]。翅果油中甾醇主要有自由态甾醇以及与脂肪酸、酚酸形成的甾醇酯两种存在形式。直压热榨法和红外热榨法翅果油中总甾醇含量显著高于直压冷榨法(p<0.05)，这可能是因为直压热榨法和红外热榨法在前处理时，部分甾醇酯发生分解，使得甾醇含量增加。不同提取工艺制得的翅果油中角鲨烯含量按由高到低的顺序为直压热榨法、超临界CO2流体萃取法、有机溶剂提取法、红外热榨法和直压冷榨法。在直压冷榨法、直压热榨法和红外热榨法中，直压热榨法制得的翅果油中的角鲨烯含量显著高于其他两种压榨提取工艺(p<0.05)，说明对翅果油树种子进行适当的热处理，更有利于翅果油中角鲨烯的提取。

表1 不同提取工艺制得的翅果油中主要生物活性成分含量 mg/100 g

2.3 翅果油中生物活性成分和抗氧化能力的相关性

对不同提取工艺制得的翅果油中的微量生物活性成分如角鲨烯、总甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羽扇豆醇、β-香树素、VE总量、α-生育酚(α-TP)、γ-生育酚(γ-TP)、δ-生育酚(δ-TP)、α-生育三烯酚(α-T3)、γ-生育三烯酚(γ-T3)和δ-生育三烯酚(δ-T3)与翅果油的抗氧化能力(DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基清除能力和Fe3+还原能力)进行相关性分析，研究不同提取工艺制得的翅果油中的微量生物活性成分对翅果油抗氧化能力的贡献，结果如表2所示。

由表2可见，不同提取工艺制得的翅果油中各微量生物活性成分与不同抗氧化能力评价指标之间的相关性各有不同。翅果油抗氧化能力与翅果油中甾醇、生育酚、生育三烯酚总量和单体，以及角鲨烯均存在极显著的正相关性(p<0.01)。

表2 不同提取工艺制得翅果油微量生物活性成分与抗氧化能力相关性分析

在本试验中，DPPH自由基清除能力与翅果油中微量生物活性成分含量的相关系数为0.811～0.916，可以推测相关系数最高的δ-生育酚和γ-生育酚是翅果油中重要的抗氧化基础物质。羟基自由基清除能力与翅果油中微量生物活性成分含量的相关系数为0.845～0.940，可以推测相关系数最高的γ-生育酚可能为翅果油中重要的抗氧化基础物质。ABTS自由基清除能力与翅果油中微量活性成分含量的相关系数为0.634～0.917，Fe3+还原能力与翅果油中微量活性成分含量的相关系数为0.554～0.853，可以推测相关系数最高的羽扇豆醇是翅果油中重要的抗氧化基础物质。因此，推测翅果油中δ-生育酚、γ-生育酚和羽扇豆醇是重要的抗氧化基础物质。

3 结 论

对翅果油抗氧化能力评价的4种方法中：在DPPH自由基清除能力评价中，5种提取工艺制得的翅果油全油及其极性和非极性部分的抗氧化能力各不相同；在羟基自由基清除能力评价中，5种提取工艺制得的翅果油全油及其极性和非极性部分的抗氧化能力相近；在ABTS自由基清除能力评价中，有机溶剂提取法的翅果油全油及其极性和非极性部分的抗氧化能力最强，超临界CO2流体萃取法的翅果油全油和极性部分抗氧化能力最弱，直压热榨法的非极性部分抗氧化能力最弱；在Fe3+还原能力评价中，有机溶剂提取法的翅果油全油和非极性部分的抗氧化能力最强，红外热榨法的极性部分抗氧化能力最强。有机溶剂提取法制得的翅果油中VE含量最高，超临界CO2流体萃取法的次之；有机溶剂提取法和超临界CO2流体萃取法的翅果油中总甾醇含量显著高于直压冷榨法、直压热榨法和红外热榨法(p<0.05)；翅果油中角鲨烯含量按照直压热榨法、超临界CO2流体萃取法、有机溶剂提取法、红外热榨法和直压冷榨法的顺序依次降低。相关性分析表明，翅果油中各生物活性成分含量与4种体外抗氧化活性指标均呈极显著正相关(p<0.01)，γ-生育酚、δ-生育酚和羽扇豆醇是翅果油中重要的抗氧化基础物质。