黏性红酵母WP3 产培养基条件的响应面优化*

王 蓉

（湖南环境生物职业技术学院图书馆，湖南 衡阳 421005）

类胡萝卜素是最大的一类天然有机色素，在一些微生物和植物中均有发现[1]。SUTTER 与WHITAKER[2]将类胡萝卜素进行分类，划分为碳水化合物类胡萝卜素和氧化的叶黄素两组，代表物分别为β-胡萝卜素和虾青素。能合成类胡萝卜素的微生物有藻类、霉菌、酵母、细菌[3]。对比来说，酵母生产类胡萝卜素更具优势，原因是酵母为单细胞生物，且生长周期短[4]。红酵母发酵存在较多影响因素，其中比较重要的是周围环境与发酵参数，尤其是培养基条件[5]。

本文采用从苹果皮上分离得到的菌株黏性红酵母WP3[6]进行类胡萝卜素发酵。首先进行单因素试验，分别是碳源、氮源、接种量和初始pH 值4 个因素。接着对单因素试验进行方差分析，得出其中的显著性因素。而后采用响应面法中的Box-Behnken 设计进一步优化类胡萝卜素生产，得到最佳参数。以最佳参数发酵，将得到的实际类胡萝卜素产量与预测值进行比较，以期用于工业化生产。

1 黏性红酵母产培养基条件优化实验材料与方法

1.1 材料与试剂

试验菌株：Rhodotorula mucilaginosaWP3[6]，使用试剂为国产分析纯，参见文献[7]。

1.2 仪器与设备

使用仪器参见文献[8]。

1.3 试验培养基

斜面培养基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，琼脂20 g，补水至1 000 mL，自然pH 值。

MS3 培养基：葡萄糖30 g，酵母粉1.5 g，NH4NO35 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.4 g，补充自来水至1 000 mL（添加微量元素）[9]。

MS3-A 培养基：酵母粉1.5 g，KH2PO41 g，NH4NO35 g， MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.4 g，补充自来水至1 000 mL（添加微量元素）。

MS3-1 培养基：葡萄糖30 g，酵母粉1.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.4 g，补充自来水至1 000 mL（添加微量元素）。

MS3-2 培养基：葡萄糖30 g，KH2PO41 g，NH4NO35 g，NaCl 0.4 g， MgSO4·7H2O 0.4 g，补充自来水至1 000 mL（添加微量元素）。

1.4 试验方法

1.4.1 保藏菌种

配制斜面培养基，将培养基加热融化，分装到试管，然后将分装的试管放入灭菌锅灭菌，趁热摆出斜面。用接种环将菌株WP3 在斜面划“Z”字形，将划好的试管放入28 ℃培养箱培养2 d，之后放入4 ℃冰箱保藏，一个月转接一次进行活化[10]。

1.4.2 培养种子

用接种环挑一环活化的菌株WP3 接种于装有50 m LMS3 培养基的150 mL 锥形瓶中，在30 ℃，150 r/min[11]的摇床中培养3 d。取5 mL 培养液放入装有50 mL MS3 培养基的容量为150 mL 的锥形瓶中，在30 ℃，150 r/min 的摇床中继续培养3 d。将培养液离心，取细胞沉淀加无菌水，混匀后计数，使接种量一致达到107个/mL[12]。

1.4.3 摇床发酵

无菌吸取一定量的种子液放入装有300 mL 培养基的500 mL 锥形瓶中，使接种量为107个/mL。在30 ℃，150 r/min 的摇床中培养7 d[4]，一次做3 组平行试验[13]。

1.4.4 测定生物量

将发酵液摇匀，取一定量该液体离心去上清，加等体积水重悬，应用紫外可见分光光度计测其在600 nm 处的吸光度值[14]。

1.4.5 提取类胡萝卜素

提取方法参见文献[8]。

1.4.6 测定类胡萝卜素含量

用紫外可见分光光度计测定发酵液在最大吸收波长450 nm 处的吸光度值，类胡萝卜素含量的计算公式[14]为

式中：A为测定液在450 nm 处的吸光度值；V为测定液体积为消光系数，指450 nm 的光线透过装有质量分数为1%的类胡萝卜素标准品的内径为10 mm 的比色杯时的吸光度值；P为用来提取类胡萝卜素的发酵液体积，L。

1.4.7 单因素试验

1.4.7.1 培养基组分的单因素试验

1.4.7.1.1 最佳碳源的确定

往MS3-A 培养基中分别加入质量浓度为30 g/L的不同碳源（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、甘油），自然pH 值，装液量为300 mL/500 mL。将菌株WP3 接种至培养基中，使接种量为107个/mL。在30 ℃，150 r/min 的摇床中培养7 d。结束培养后，进行生物量与类胡萝卜素含量的测定，以研究最适碳源。

以MS3-A 为基础培养基，各加入果糖，使其质量浓度分别为10 g/L，20 g/L，30 g/L，40 g/L，50 g/L，维持自然pH，装液量为300 mL/500 mL。将菌株WP3 接种至培养基中，接种量为107个/mL。在30℃，150 r/min 的摇床中培养7 d。结束培养后，进行生物量与类胡萝卜素含量的测定，以研究最佳碳源质量浓度。

1.4.7.1.2 最佳氮源的研究

1） 无机氮源。往MS3-1 培养基里各加入不同氮源（KNO312.63 g，NH4Cl 6.69 g，NH4NO35 g），使含氮量达到1.75 g/L，装液量为300 mL/500 mL。将菌株WP3 接种至培养基中，接种量为107个/mL。在30 ℃，150 r/min 的摇床中培养7 d。结束培养后，进行生物量与类胡萝卜素含量的测定，以研究最佳无机氮源。

在MS3-1 培养基里加入不同质量浓度的NH4Cl（1.15 g/L，2.29 g/L，3.44 g/L，4.59 g/L，5.73 g/L，6.88 g/L），装液量为300 mL/500 mL。将菌株WP3接种至培养基中，接种量为107个/mL。在30 ℃，150 r/min 的摇床中培养7 d。结束培养后，进行生物量与类胡萝卜素含量的测定，以研究最佳无机氮源浓度。

2） 有机氮源。往MS3-2 培养基里各加入质量浓度为10 g/L 的有机氮源（尿素、酵母粉、蛋白胨），装液量为300 mL/500 mL。将菌株WP3 接种至培养基中，接种量为107个/mL。在30 ℃，150 r/min 的摇床中培养7 d。结束培养后进行生物量与类胡萝卜素含量测定，以研究最适有机氮源。

以MS3-2 为基础培养基，各加入酵母粉，使质量浓度分别为3 g/L，5 g/L，10 g/L，15g/L，装液量为300 mL/500 mL。将菌株WP3 接种至培养基中，接种量为107个/mL。在30 ℃，150 r/min 的摇床中培养7 d。结束培养后，进行生物量与类胡萝卜素含量的测定，以研究最佳有机氮源浓度。

1.4.7.2 摇床发酵条件的单因素试验

1） 接种量。配制MS3 培养基，装液量均为300 mL/500 mL，使接种量变化，各达105个/mL、105.5个/mL、106个/mL、106.5个/mL、107个/mL，置30 ℃，150 r/min 的条件下发酵7 d。终止发酵后，进行生物量与类胡萝卜素含量的测定，求得最适接种量。

2） 初始pH 值。配制MS3 培养基，装液量为均300 mL/500 mL，使初始pH 值不同，分别为4，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，将菌株WP3 接种至培养基中，接种量为107个/mL。在30 ℃，150 r/min 的摇床中培养7 d。培养结束后，测量类胡萝卜素含量和生物量，得出最佳初始pH 值。

1.4.8 单因素试验的方差分析

综合试验对类胡萝卜素含量的影响，对单因素试验进行方差分析，根据P值选出显著的影响因子（P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异高度显著，P＜0.001 为差异极显著）[15]。

1.4.9 响应面优化试验

根据单因素试验，得出对类胡萝卜素含量影响的显著因子，选择Design Expert 8.0 软件[16]，将响应值设为类胡萝卜素含量，进一步优化，确定最优工艺参数，用该参数进行验证。

2 黏性红酵母产培养基条件优化实验结果与分析

2.1 培养基组分的单因素试验

2.1.1 最佳碳源的确定

培养结束后，测量类胡萝卜素含量和生物量，结果见文献[8]。通过分析得出果糖为最佳碳源，最佳果糖质量浓度为40 g/L。

2.1.2 最佳氮源的研究

1） 无机氮源。培养结束后，测量类胡萝卜素含量和生物量，结果见文献[7]。通过分析得出最佳氮源为氯化铵，最佳氯化铵氮质量浓度为0.9 g/L，即氯化铵质量浓度为3.44 g/L。

2） 有机氮源。培养结束后测量类胡萝卜素含量和生物量，见图1 和图2（均显示均值标准差）。

图1 几种有机氮源对Rhodotorula mucilaginosa WP3生物量和类胡萝卜素合成的影响

图2 不同浓度酵母粉对Rhodotorula mucilaginosa WP3生物量和类胡萝卜素合成的影响

由图1 可见添加尿素时生物量最小，细胞生长不好，而添加酵母粉时生物量最大，菌株长势较好，表明加入尿素不适于红酵母生长；而加入酵母粉时，测得最大类胡萝卜素含量，加入蛋白胨时，得到最小类胡萝卜素含量，表明添加蛋白胨对合成类胡萝卜素不利，综合可见酵母粉是最佳有机氮源。FERRAO 等[17]研究禾本红酵母RC04 在β-胡萝卜素合成和细胞生长时不同碳源的影响，得出有机氮源中最利于细胞生长和β-类胡萝卜素合成的有机氮源也是酵母粉。

由图2 可见酵母粉浓度越大，菌株生物量也越大，表明稍高浓度酵母粉促进菌株生长。添加质量浓度为15 g/L 酵母粉，得到最低类胡萝卜素含量，表明类胡萝卜素的次级代谢合成同菌株生长不是正比关系。添加质量浓度为10 g/L 酵母粉，得到类胡萝卜素含量最大，细胞长势也较好，说明酵母粉最佳质量浓度为10 g/L。翟红梅[18]用红酵母进行5 L罐发酵，结果显示质量浓度为20 g/L 是酵母粉最适宜质量浓度，此试验与本研究有出入，大致缘由是菌株差异。

2.2 摇床发酵条件的单因素试验

1） 接种量。结束培养后进行生物量与类胡萝卜素含量的测定，见图3（显示均值标准差）。

图3 接种量对Rhodotorula mucilaginosa WP3生物量和类胡萝卜素合成的影响

由图3 可见，当接种量达到3.16×105个/mL（即105.5个/mL） 时，得到最小生物量；而当接种量达到1×106个/mL 时，得到最大生物量，表明菌株生长的最佳接种量是1×106个/mL。但接种量达到1×106个/mL 时，所得类胡萝卜素含量却最小；接种1×105个/mL 时，得到最大类胡萝卜素含量，这表明类胡萝卜素合成同菌株生长不是正比关系，1×105个/mL 是最适宜接种量。Govindaswamy Vijayalakshmi 等[19]优化红酵母类胡萝卜素合成，接种量表达形式不同，为6.0 mL/100 mL。

2） 初始pH 值。培养结束后，测量类胡萝卜素含量和生物量，结果见文献[8]。分析该图得出最适初始pH 值为7.5。

2.3 单因素试验的方差分析

方差分析单因素试验，研究其对类胡萝卜素含量的影响。从第84 页表1 可见，果糖浓度与初始pH 值对类胡萝卜素含量影响极显著，酵母粉质量浓度对类胡萝卜素含量影响高度显著，而接种量和NH4Cl 质量浓度影响类胡萝卜素含量不显著。根据单因素试验对类胡萝卜素含量的影响，选出3 个影响因子：初始pH 值、果糖质量浓度、酵母粉质量浓度，并将响应值设为类胡萝卜素含量，进一步响应面优化。

表1 单因素试验对类胡萝卜素含量的方差分析表

2.4 响应面试验

1） 优化方案。研究红酵母菌株类胡萝卜素合成，单因素试验后用响应面法进一步优化，软件应用Design Expert 8.0，选择Box-Behnken 设计，确定3 个考察因子：初始pH 值A、果糖质量浓度B、酵母粉质量浓度C，将响应值设为类胡萝卜素质量浓度Y，三水平三因子优化发酵，方案设计与试验结果见表2 和表3。响应面优化试验菌株发酵，得到的类胡萝卜素含量比单因素试验高43.96%。

表2 试验设计因子与水平取值

采用响应面法回归分析试验数据（见表3），综合可得以类胡萝卜素含量为响应值的三因子（初始pH 值A、果糖质量浓度B、酵母粉质量浓度C） 的三元二次回归方程为

对此方程进行显著性检验与方差分析，结果见表4。从表4 可见，回归模型P值＜0.000 1，表明得到的模型差异极显著，模型的失拟项P值为0.144 7＞0.05，表明失拟项差异不显著，此方程模型与发酵情形很好拟合，因而发酵可用模型代替进行结果分析。该模型的（决定系数）为0.999 2，表明99.92%类胡萝卜素含量的变化能用此模型解释，实际发酵中用此模型仅存在0.08%的变异不能说明。所以研究所得模型能可靠地应用于试验菌株的发酵，能够预测试验得到的类胡萝卜含量，清楚其变化。

表3 Box-Behnken 试验设计与响应值

表4 回归模型方差分析

2） 最佳发酵参数的预测及验证。综合处理试验数据，选择Design Expert 8.0 软件进行优化与预测，得到发酵的最优工艺参数：酵母粉质量浓度为7.13 g/L，果糖质量浓度为41.70 g/L，初始pH 值为7.61。将最优参数代入方程得到类胡萝卜素质量浓度预测值为678.967 μg/L。采用最优参数进行试验，得类胡萝卜素含量试验值为678.048 μg/L，预测值和试验值接近，表明选择响应面方案所得模型与参数可信度高。

3 结论

本试验先开展单因素试验，在此基础上，用响应面法优化试验菌株类胡萝卜素合成工艺，建立了显著影响因子对类胡萝卜素含量的三元二次回归方程模型，通过验证，该回归模型可信度高，能用来预测类胡萝卜素含量。综合单因素试验与响应面优化试验，得出试验菌株最佳发酵参数是果糖质量浓度为41.70 g/L，酵母粉质量浓度为7.13 g/L，初始pH 值为7.61。以最佳参数预测与验证，类胡萝卜素质量浓度实际值为678.048 μg/L，预测值为678.967 μg/L，实际值与预测值很接近。