tDCS对中风大鼠功能恢复和Notch信号通路的影响

段军秀，郑嵋戈，穆淑花，田大胜，许新忠，贺震旦，张 健

1)深圳大学基础医学院，广东深圳518060；2)明斯特大学生物物理及生物医学研究所，德国明斯特 48149；3)安徽医科大学第二附属医院骨科，安徽合肥230601；4)深圳大学心理学院，广东深圳518060

脑卒中是临床上较常见的一种突发性脑血管疾病.脑卒中发病时，脑动脉突然被阻塞，造成局部脑组织供血不足，导致该区域脑组织受损，影响机体的神经功能.ZHAO等[1]研究表明，在缺血再灌注的脑组织中，Notch信号通路被显著激活，参与脑缺血后的病理改变及功能恢复过程.Notch信号通路是一个进化高度保守的信号通路，介导相邻细胞间信号交换，影响神经发育过程中的细胞分化、增殖与凋亡等多种程序，并在神经功能的恢复过程中起十分重要的作用[2].Notch1是Notch信号通路的受体蛋白，在神经系统发育过程中调节神经前体细胞分化，同时控制着突触蛋白可塑性变化.Notch1的胞内接头蛋白NICD(Notch intracellular domain)及下游转录因子RBP-JK(recombination signal binding protein-JK)调控着细胞增殖和细胞分化等过程[3].上述基因的表达水平常作为Notch信号通路激活的重要标志.

经颅直流电刺激(transcranial direct current stimulation, tDCS)作为无创性脑刺激技术之一，具有独特优势，而且安全性高.临床研究表明，tDCS在肢体运动功能提高、记忆能力改善和神经功能恢复等方面具有可观的疗效[4].但是，tDCS的潜在神经生物学机制仍然知之甚少，因此也阻碍了其在临床中的应用.本研究在中风大鼠双眼眶上孔和眶下缘和鼻交点处采用模拟临床的tDCS疗法，研究tDCS对中风大鼠功能恢复和Notch信号通路的影响，以期为tDCS的临床应用提供一定的理论依据.

1 实验材料和方法

1.1 实验动物分组

实验采用成年SD(sprague dawley)大鼠，质量为250～300 g.实验动物的购买及饲养均经过深圳大学医学部医学伦理委员会审批，所有实验动物饲养在无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级动物房，且自由觅食进水.模型制作前24 h实验动物禁食.实验动物共分为4组：① 模型组，即中脑动脉闭塞(middle cerebral arterial occlusion, MCAO)(n=18只)；② 治疗组MCAO+tDCS(n=18只)；③ 假手术组sham(n=9只)；④ 假治疗组sham+tDCS(n=9只).① 和 ② 组每组9只用于2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazole chloride, TTC)染色，9只用于实时定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)实验.假手术组和假治疗组各9只用于RT-PCR实验.所有大鼠在造模后取材前都参加行为学测试实验，每组分别于造模后5、10和15 d取材.

1.2 大脑中动脉栓塞模型

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠80 mg/kg麻醉.造模方法参考文献[5]，线拴采用进口鱼线，剪成3 cm 长度，用记号笔在1.8～2.0 cm处进行标记，将头部5 mm在石蜡中沾一下进行包被，用蒸馏水清洗晾干紫外消毒30 min后放入无菌多聚赖氨酸中浸泡10 min.颈前部皮肤去毛消毒，做颈部正中切口，分离左侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉，并分别穿线备用.在颈外动脉远心端结扎(确保残端长度不小于0.5 cm)将颈总动脉和颈外动脉用动脉夹夹闭阻断，用手术剪在颈外动脉靠近结扎处做一个横向切口，将处理好的线栓从右侧颈总动脉残端插入颈内动脉，用事先穿好的手术线打结系住线栓和血管，使之不易脱出.从切口处剪断颈外动脉残端，牵拉颈外静脉残端与颈内动脉成一条直线，松开颈内动脉动脉夹，通过向大鼠左上方提拉环绕颈内动脉的手术线调整线栓插入的角度，将线栓送入颈内动脉18～20 mm(记号笔标记处)，感觉有阻力时停止插入线栓.扎紧手术线，固定线栓位置.松开颈总动脉的动脉夹.栓塞大鼠大脑中动脉2 h，期间大鼠体温保持在(37±1)℃.轻轻拔除线栓，手术线扎紧颈外动脉残端，缝合伤口，实现再灌注.假手术组大鼠麻醉后仅暴露颈内和颈外动脉分支，不栓塞大脑中动脉.

1.3 经颅直流电刺激

实验采用深圳创信医疗有限公司的脑反射治疗仪，结合该仪器在临床治疗过程中的使用方法和参数，大鼠在造模后24 h开始接受tDCS治疗，每次治疗前对大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行浅麻醉(40 mg/kg)，大鼠俯卧于舒适台面上，将探头安装在大鼠双眼眶上孔、眶下缘与鼻翼交汇点，探头上的导电介质调整到最佳位置，避免介质渗入眼睛，如图1(a)和(b).首次治疗电压不超过30 V、(50±2%)Hz；第2次以后手动增幅使电压保持在(30±3)V，持续时间为15 min，治疗过程中大鼠会出现眼匝轮肌节律收缩，随着电压幅值增大还伴有口匝轮肌收缩现象.每隔24 h治疗1次，最后1次tDCS治疗结束30 min后处死动物取材.假手术组与模型组只安置头部探头，不给予电流.

图1 电刺激装置及位置

1.4 神经功能损伤评估

治疗前后神经功能的变化采用神经系统严重程度评分(modified neurological severity score, mNSS)进行评估[6].对实验动物在造模前一天及造模后每24 h进行行为学评分，持续到该实验动物被处死.该量表能够精确的反映整个tDCS治疗过程中每组实验动物康复过程中神经功能的变化.该评分量表主要包括：运动能力、感知能力、平衡能力和曲张能力，评分为0～18分，正常大鼠评分为0，损伤最严重的为18分，测试的各项目中如果大鼠无法完成相应实验就得1分，能够顺利完成不得分，评分越高，表示神经功能损伤越严重.

1.5 缺血面积计算

实验中采用TTC染色的方法计算缺血面积.TTC能够与脑组织中活性的脱氢酶反应，染色后脑组织呈红色；而脑缺血后，脑组织中脱氢酶活性下降，染色后脑组织呈白色.大鼠过量麻醉后取新鲜脑组织，用生理盐水洗去表面血渍后将脑组织于-20 ℃冰箱中放置15 min后取出，用锋利的刀片将脑组织冠状连续切片，厚度约2 mm.将脑切片浸入体积分数为1%的生理盐水配置的TTC溶液中，避光，37 ℃孵育15 min后取出拍照.实验结果用Image J软件进行分析[7].缺血面积S计算公式为

S=[(Vc-VL)/Vc]×100%

(1)

其中，Vc为对照一侧半脑的体积；VL为缺血一侧正常脑组织的体积.

1.6 RT-PCR实验

脑组织总核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)提取采用TRIzol试剂盒(购自美国Invitrogen公司)提供的提取步骤，各组大鼠深度麻醉后，取新鲜脑组织，分离出海马和纹状体，将组织剪碎后按组织重量每100 mg加入1 mL RNase plus，将组织研磨充分后离心，取上清溶液，加入氯仿(RNase plus和氯仿体积比为5∶1)，剧烈震荡后室温静置5 min，离心取上清液.向上清液中加入等体积的异丙醇溶液，充分混匀后室温静置10 min.离心后弃上清，沿离心管壁缓慢加入体积分数为75%的乙醇1 mL，轻轻上下颠倒充分洗涤离心管壁残留的提取液，离心后小心吸出乙醇，室温放置5 min使沉淀完全干燥后加入适量的RNase-free水，用酶标仪检测RNA浓度，随后于-80 ℃保存.用RT-PCR逆转录试剂盒(购自美国Takara公司)将RNA反转录成互补脱氧核糖核酸(complement deoxyribonucleic acid, cDNA).逆转录产物采用实时荧光定量试剂盒(购自美国Takara公司)进行定量分析.每40 ng cDNA模版加入实时荧光定量试剂盒中的2×SYBP green mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，并加入7.2 μL无RNA酶的水，使反应体系最终体积为20 μL.整个扩增过程采用两步法：NeuN，GFAP,SYP采用95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，55 ℃，20 s；共40个循环.Notch信号通路的检测采用95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，20 s；共45个循环.引物序列如表1.实验结果采用2-△△CT法，即

表1 RT-PCR所用的引物序列

△△Ct=(Ct治疗组目的基因-Ct治疗组β-actin)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组β-actin)

(2)

其中，Ct治疗组目的基因为治疗组相应基因的阈值循环；Ct治疗组β-actin为治疗内参基因的阈值循环；Ct对照组目的基因为假治疗组相应基因的阈值循环；Ct对照组β-actin为假治疗组内参基因的阈值循环.

1.7 统计学分析

2 实验结果及分析

2.1 tDCS促进大鼠脑缺血后神经功能的恢复

为研究tDCS是否促进脑缺血大鼠的神经功能改善，研究采用mNSS的方法对大鼠进行神经功能测试.神经功能评分结果显示，sham组和sham+tDCS组的大鼠神经功能评分接近为0，说明假手术并未对大鼠神经功能造成损伤，也同时证明了tDCS治疗方法的安全性，如图2(a).与MCAO组相比，MCAO+tDCS组在术后第5天，神经功能缺损评分显著降低，如图2(a)，在术后第9～15天神经功能缺损也明显改善，如图2(a).以上结果表明，tDCS治疗能促进大鼠脑缺血后功能的恢复.

图2 经颅直流电刺激治疗对中风大鼠神经功能和脑梗死面积的影响

2.2 tDCS治疗能够缩减受累脑区的脑缺血面积

为研究tDCS治疗对大鼠脑缺血面积是否有所改善，本研究采用TTC染色法，对术后第5、10和15 d脑缺血面积改变情况进行观察比较.结果显示：MCAO组在术后第5天，患侧受累脑区包括基底节外侧区、顶叶和颞叶(部分区域)，且脑组织有轻微水肿，缺血面积为(36.13±5.50)%，如图2(b)和(c)；术后第10天，脑组织水肿消退，脑缺血面积为(36.68±5.43)%，如图2(b)和(c)；术后第15天，患侧受累脑区减小，脑缺血面积为(35.03±5.08)%，如图2(b)和(c).与MCAO组相比，MCAO+tDCS组在术后第5天患侧受累脑区缺血面积没有显著性减小.术后第10天，MCAO+tDCS组缺血面积减少为(27.30±2.04)%(P<0.05)，如图2(b)和(c)；术后第15天，与MCAO组相比，MCAO+tDCS组缺血面积下降了(7.36±1.95)%，如图2(b)和(c)，差异显著(P<0.05)，如图1(b)和(c).以上数据表明，tDCS能够减小患侧受累脑区的缺血面积.

2.3 tDCS能够促进Notch信号通路受体蛋白及下游转录因子mRNA的表达

为研究脑缺血后tDCS治疗对Notch信号通路的影响，采用RT-PCR技术，检测各组脑组织纹状体和海马区中Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1的基因表达变化.结果表明，上述基因的mRNA表达在MCAO组和MCAO+tDCS组均显著高于sham组和sham+tDCS组；而后两组之间没有明显差异，如图3(a)、(b)、(c)和(d).术后第5天，在大鼠的纹状体与海马区，与MCAO组相比，MCAO+tDCS组上述4个基因表达量没有显著性差异，如图3；术后第10天，与MCAO组相比，MCAO+tDCS组中Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1的mRNA表达变化在纹状体区没有统计学差异如图3(e)、(f)、(g)和(h)，而在海马区Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1基因的表达却显著上调，如图3(a)、(b)、(c)和(d)；术后第15天，与MCAO组相比，MCAO+tDCS组Notch信号通路中Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1在纹状体区mRNA表达量均有所增加，如图3(e)、(f)、(g)和(h)，而在海马区Notch1和 Hes-1的mRNA表达量明显上调，如图3(a)和(d)；与MCAO组相比，MCAO+tDCS组NICD与RBP-JK的mRNA表达量也有显著性差异，如图3(b)和(c).结果显示，大鼠脑缺血后能够激活Notch信号通路，tDCS促使Notch信号通路受体及下游转录因子基因表达上调.

3 讨 论

综上研究结果表明，采用多导脑反射仪治疗作用在双眼眶上孔和眶下缘以及鼻交点处的经颅直流电刺激疗法可以显著减少脑梗死体积，从而改善中风后功能恢复.本研究可为经颅直流电刺激的治疗提供相应的实验依据.

经颅直流电刺激已被视为有效辅助疗法，可加快中风后神经功能的恢复.经颅直流电刺激通过改变静息膜电位来调节自发性神经网络的活动[4]，这种活动取决于电极的位置[8-9].许多研究集中在经颅直流电刺激对运动皮层的影响上，因为经颅直流电刺激在运动神经功能的恢复中起着重要作用，例如肢体运动和记忆力的改善[10-11].但其机制仍不清楚.本研究中，刺激区域是双眼眶上孔和眼眶下缘与鼻翼的交点.通过刺激三叉神经上颌、下颌和眼神经的分支丛，神经兴奋被传递到中枢神经系统，进一步调节运动皮层，并将神经兴奋传递到损伤部位以达到治疗效果.在刺激过程中可观察到大鼠面部肌肉群和肢体肌肉群有规律的震颤.结果表明，建模5～15 d，mNSS得分在0～2分变化.治疗后，mNSS评分为6～9分，仍处于中度损伤，但是治疗组的改善明显优于对照组.同时TTC染色显示治疗组缺血面积较模型组明显减小.

脑梗塞后神经功能恢复涉及的信号通路多种多样.已经有研究证明Notch信号通路与大鼠脑缺血后神经细胞的存活[12]、分化和迁移密切相关[13].本研究以tDCS为干预手段，检测大鼠脑缺血治疗前后Notch下游转录因子的表达变化.Notch1是一个跨膜蛋白，已有研究数据显示，Notch1过表达能够促进细胞增殖[14]，同时Notch1的激活能调控和神经元前体细胞的增殖和分化[15].实验中Notch信号通路被激活，治疗组中Notch1的mRNA表达在纹状体区和海马区明显上调，有显著性差异的时间出现在造模后第15天(图3).说明tDCS治疗能够促进Notch1基因的高表达.Hes-1是Notch信号通路下游的一个调控因子，能够有效地调控神经元的迁移[16]，细胞中如果过量表达NICD则能够增加新生细胞的存活率，如果细胞中缺少Hes-1蛋白，则会加速神经细胞的凋亡[2].研究发现，tDCS能够使海马区Hes-1基因在治疗后mRNA表达量上调，如图3(h)，与此相对应的实验数据显示tDCS加速大鼠神经功能的恢复，如图2(a).WANG等[17]研究表明，Notch信号通路能够调节中风后成熟的神经元前体细胞增殖和分化，在这个过程中Notch信号通路相关因子高表达.采用Notch信号通路抑制剂DAPT和siRNA能够使NICD、Notch1和Hes-1表达明显下调，同时使神经元数量减少.本实验结果显示，tDCS干预的脑缺血大鼠在神经功能恢复过程中Notch信号通路的受体及下游转录因子的基因表达上调，与上述研究结果一致.本研究未对Notch信号通路进行阻断，现有的数据不足以证明tDCS促进的Notch信号通路中Notch1、NICD、RPB-JK和Hes-1的mRNA表达上调与神经功能恢复呈正相关.但是现有实验证据说明，大鼠脑缺血后能够激活Notch信号通路并参与脑缺血损伤的修复，同时tDCS有助于进一步提高该通路中Notch1、NICD、RPB-JK和Hes-1的mRNA表达.

图3 tDCS提高Notch信号通路受体及下游转录因子mRNA的表达

结 语

本研究使用线拴法建立大鼠大脑中动脉栓塞脑缺血再灌注模型，采用神经功能评分量表观察治疗前后大鼠神经行为学，神经功能的变化，依据TTC染色差异比较治疗前后大鼠脑缺血面积的改善情况，并结合RT-PCR技术，从组织和细胞分子层面研究tDCS作用机制.结果表明，tDCS使Notch信号通路中Notch1、NICD、RPB-JK和Hes-1基因表达上调，同时减少了缺血大鼠的缺血面积并加速缺血性中风后功能的恢复.该研究为经颅直流电刺激促进脑梗死后神经功能康复提供了部分实验与理论依据.与其他研究方法相比，该方法简化了治疗步骤.因此，可将该设计前瞻性地发展为一种临床治疗方式，且仅通过戴上类似目镜的设备就能使患者得到治疗.