绵羊PER3基因组织表达及多态性与季节性繁殖的相关性研究

向光明，刘秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，马 琳，曾宪垠，曹晓涵*，储明星*

(1. 中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京100193；2. 四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014)

中国是传统的养羊大国，但大部分绵羊属于季节性繁殖品种，严重限制了绵羊的生产效率[1]，因此从分子角度寻找与绵羊繁殖相关的基因具有重要的意义。

PER3基因在1988年由两个独立的团队克隆并发表[2-3]，其蛋白序列与PER1、PER2差异较大，绵羊的编码区序列与人、小鼠和牛的相似度只有60%左右[4]。PER1、PER2是生物钟的核心成分，对生物钟的调控起着重要作用，然而PER3基因是否对生物钟起着重要调控作用还不明确。已有研究发现PER3蛋白是生物钟基因转录复合物的成分之一，PER3作为生物钟基因的核心组分，有可能是一种钟控基因[5-6]。目前，关于PER3的研究主要集中在睡眠、疾病等方面，很多研究发现PER3基因的第18外显子中存在54个碱基的4或5次的非直接重复序列，即串联重复多态性(VNTR),该突变与人的睡眠以及大脑活动有关[7-9]；Zhu等[10]和郭煜升等[11]也发现PER3的多态性与乳腺癌、肝细胞癌有关。近年来很多研究表明，生物钟对哺乳动物繁殖有着重要调控作用，钟基因不仅在繁殖相关的重要组织中节律表达，且异常表达的钟基因可能导致繁殖能力下降，甚至不育[12-14]。Nakao等[15]在日本鹌鹑中发现PER3基因与优势卵泡的发育有关；Delaunay等[16]在斑马鱼中发现PER3基因在胚胎发育中起着关键作用；Lin等[17]在大鼠中发现高脂的生活习惯能影响卵泡的发育，同时能够影响PER3基因的表达水平，但钟基因PER3是否对绵羊季节性繁殖具有调控作用还未见报道。

本试验一方面探究PER3基因对季节性发情的影响，另一方面研究PER3多态性与绵羊产羔数的关联，综合分析PER3基因对绵羊季节性繁殖的影响，为肉羊繁殖的分子遗传机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集和主要试剂

苏尼特羊和小尾寒羊均来自天津市畜牧兽医研究所试验基地。选取健康的非发情苏尼特羊母羊(长光照)和小尾寒羊母羊(黄体期)各3只，在同期发情后第7天进行屠宰，然后分别采集下丘脑、垂体、松果体、大脑、小脑、卵巢、子宫体、输卵管、肾和肾上腺10种组织，迅速将采集的新鲜组织装入2 mL的RNase-Free冻存管中，并立即置于液氮，带回实验室后全部转移至-80 ℃保存备用。

1.2 组织总RNA的提取和cDNA的合成

采用动物组织总RNA提取试剂盒(天根)加Trizol(Invitrogen)提取各组织总RNA[18]，并用Nanodrop 2000检测提取RNA的浓度和OD值，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。质检合格的RNA进行反转录，合成cDNA，具体的反应程序和体系参照试剂盒说明书。

1.3 引物设计

根据GenBank提供的绵羊PER3基因mRNA的预测序列(登录号为XM_012187372.1)，利用Primer 3.0在线软件进行跨外显子引物设计，以β-actin(NM_001009784)作为内参基因，引物信息见表1，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

表1 绵羊PER3基因的引物信息Table 1 Primer information of PER3 gene in sheep

1.4 qPCR 反应

1.4.1 qPCR反应体系和程序 反应体系(20 μL)：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s，63 ℃ 30 s，40个循环。反应结束后对熔解曲线进行分析。

1.4.2 标准曲线的建立 将cDNA样本5倍稀释后，再进行2倍梯度稀释获得5个浓度梯度的cDNA样品，以5倍稀释的cDNA样本浓度为1，则这5个cDNA样品的浓度梯度分别为1、1/2、1/4、1/8和1/16。用这些cDNA作为模板对目的基因和内参基因进行荧光定量PCR，以浓度梯度的对数值(10为底数)为横坐标，以检测所得Ct值为纵坐标，绘制目的基因和内参基因标准曲线。

1.5 分型样品

1.6 数据分析

采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量[18-20]，用SPSS 22统计软件中的一般线性模型中单因素方差分析的 Duncan法，对不同发情性状之间PER3基因的相对表达量进行分析，并对该基因的不同SNPs与小尾寒羊产羔数做关联分析。用Excel 2016计算PER3基因不同SNPs的的不同基因型在季节发情和常年发情之间的差异，同时进行群体遗传学分析(包括基因型频率、等位基因频率、多态信息含量等)，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取和cDNA合成

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对RNA的完整性进行检测。如图1所示，RNA完整性良好，同时以β-actin为内参，PER3为目的基因作标准曲线，得到单一且锐利的熔解曲线，说明引物特异性好，可以进行后续的荧光定量试验。

2.2 PER3基因在不同绵羊组织的表达

qPCR结果表明，PER3基因在季节性发情的苏尼特羊和常年发情的小尾寒羊繁殖相关各组织中均有表达；苏尼特羊的PER3基因表达量在松果体中显著高于小尾寒羊(P<0.05)，子宫中差异极显著(P<0.01)，其它组织中两个品种之间的表达量无显著差异(P>0.05)，但除了输卵管外，PER3基因在其它组织(下丘脑、垂体、卵巢)的表达量均略高于小尾寒羊(图2)。

2.3 PER3基因的多态性分析

对PER3基因13个SNPs进行分型，结果表明，PER3基因g.43657503A>G、g.43669480T>C、g.43669727T>C、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43677259T>C、g.43677274T>C和g.43707227G>A等8个SNPs在常年发情和季节性发情绵羊有3种基因型，g.43669493T>C、g.43670763C>T、g.43670925C>T、g.43677962A>G和g.43701901A>G 5个SNPs在两种不同发情品种的绵羊中只有2种基因型(图3)。

为了研究PER3基因13个SNPs在季节性发情和常年发情绵羊品种之间分布的差异，在两种不同发情性状的绵羊中分别对不同SNPs的基因型和等位基因进行统计，如表3所示。其中g.43657503A>G、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43677259T>C和g.43707227G>A 5个SNPs在季节性发情和常年发情绵羊品种中的基因型频率、等位基因频率均达到显著差异(P<0.05)。

对5个在2种不同发情性状绵羊频率分布具有显著差异的SNPs在6个绵羊品种中进行群体遗传学分析，如表3所示。

表2 PER3基因不同SNPs在季节性发情、常年发情绵羊中基因型频率和等位基因频率Table 2 Genotype and allele frequencies of different SNPs at PER3 gene in seasonal and year-round estrous sheep

表3 PER3基因不同SNPs在6个不同绵羊品种中的群体遗传学分析Table 3 Population genetic analysis of different SNPs at PER3 gene in 6 sheep breeds

2.4 PER3基因与小尾寒羊产羔数的关系

统计发现在380只具有产羔数记录的小尾寒羊中，共检测到12个SNPs(如表4)。其中g.43657503A>G、g.43669493T>C、g.43669727T>C、 g.43670925C>T、g.43677962A>G、g.43701 901A>G 6个位点只有两种基因型，它们的野生型数量远远高于突变型，虽然两种基因型之间的产羔数并无显著差异(P>0.05)，但这种少量的杂合突变导致产羔数降低。其它6个位点有3种基因型，其中g.43669480T>C、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43707227G>A 4个位点的突变型数量远远高于野生型，虽然4个位点与产羔数并无显著关联(P>0.05)，但这种突变往往导致产羔数增加，纯合突变更加明显。g.43677259T>C和g.43677274T>C位点的突变型也较多，但纯合突变少，且有趣的是这种突变却导致产羔数减少，纯合的减少更多。

表4 PER3基因不同位点各基因型小尾寒羊产羔数最小二乘均值及标准误Table 4 Least squares means and standard errors of litter size of different genotypes of SNPs at PER3 gene in Small-tail Han sheep

3 讨 论

3.1 PER3基因在绵羊繁殖相关组织之间的表达分析

本研究发现PER3基因在季节发情的苏尼特羊和常年发情的小尾寒羊繁殖相关的组织中均有表达，这与核心钟基因在哺乳动物体内各组织表达相一致[21-22];另在两种绵羊中，PER3基因在下丘脑和子宫中的均表达高于其它组织，说明有一定的组织特异性，这与之前Pendergast等[23]的研究结果一致。

哺乳动物季节性发情的主要生理过程是光照→下丘脑→松果体→下丘脑-垂体-性腺轴系统，其中松果体分泌的褪黑激素是季节性繁殖动物生殖行为随光周期变化的中心信号分子[24]，下丘脑、垂体是季节性发情调控的控制中心[25-26]，在季节性发情苏尼特羊和常年发情小尾寒羊中对PER3基因表达量进行比较，发现松果体中PER3基因的表达量在苏尼特羊中显著高于小尾寒羊，下丘脑、垂体中PER3基因的表达量也高于小尾寒羊，说明PER3基因很可能对季节性发情起着重要调控作用，且有可能是在发情信号通路的上游发挥作用，Delaunay等[16]发现PER3基因在斑马鱼胚胎的中枢神经系统和视网膜中纪律性表达也反映了这一点。另外两种绵羊都处于非发情期，光照刺激通过增强雌激素的负反馈作用而抑制性腺轴的活性[24]，GnRH/LH周期性释放活动停止，导致PER3基因在两种羊的下丘脑、垂体和卵巢的表达量都降低。在卵巢和子宫中，苏尼特羊PER3基因的表达量都高于小尾寒羊。卵巢是卵泡发育的场所，说明PER3基因较高表达可能与卵泡的发育调控有关。Nakao等[15]在家禽中发现,在排卵前的大卵泡中有PER3基因的节律表达,而在小卵泡中没有也说明了这一点。研究表明哺乳动物发情、排卵等行为又受生物钟的调控[27]，所以PER3基因可能作为钟控基因调节PER1、PER2基因的表达，进而影响两种绵羊卵巢中不同激素的表达情况来调控绵羊的发情性状。子宫中苏尼特羊PER3基因的表达量显著高于小尾寒羊，可能与该时期子宫状态有关。子宫对着床的敏感度分为3个时期，即预受期、接受期及不应期，而子宫只有在接受期才能接受和适应胚胎。本试验的小尾寒羊刚进入黄体期，子宫可能处于不应期，PER3的表达量较低。另外还有很多研究表明输卵管和子宫中的钟基因PER3的表达可能与受精和胚胎的发育有关[16,28-29]。

3.2 PER3基因多态性与绵羊季节性发情的关系

通过重测序在6个绵羊品种中发现了PER3基因的13个SNPs，其中g.43657503A>G、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43677259T>C和g.43707227G>A 5个SNPs在季节性发情和常年发情绵羊品种中的基因型频率、等位基因频率均达到显著差异，表明其可能是与绵羊的季节性发情重要的关联位点。对这5个SNPs的群体遗传学分析发现，仅g.43657503A>G和g.43677259T>C 2个位点在小尾寒羊和苏尼特羊中均表现为中度多态性，说明这两个位点在小尾寒羊和苏尼特羊具有较强的选择潜力。其它位点在不同绵羊品种中多态性不一致，表明不同的SNPs在不同绵羊品种中的选择潜力不同，这与之前的研究相一致[30]。而且这5个SNPs在6个绵羊品种中均处于哈代温伯格平衡,表明经过长期进化和选择，这些位点在适应性方面具有一定的遗传优势。

3.3 PER3基因与绵羊产羔数的关系

通过上述突变位点与小尾寒羊1～3胎产羔数关联分析可知，虽然这些突变位点与各胎产羔数并不显著关联，但PER3基因位点突变在一定程度上还会影响小尾寒羊各胎产羔数。通过进一步分析发现少量个体的杂合突变位点(如g.43657503A>G、g.43669493T>C等)基本都会导致1～3胎的产羔数降低，而从进化角度来说，群体产羔数减少意味着群体数量减少，不利于群体进化，这就说明这些突变对绵羊群体来说是一种有害突变。而大量的突变甚至有大量的纯合突变(如g.43669480T>C、g.43670012T>C、g.43670807A>G等)会导致小尾寒羊1～3胎的产羔数提高，而且往往纯合突变升高的更明显，说明这些突变位点对绵羊群体是一种有益突变。当然这些位点与小尾寒羊各胎的产羔数均不显著关联的原因可能是小尾寒羊产羔数的产羔数是一个受多个基因共同影响的表型，而目前已经发现FecB基因是影响小尾寒羊产羔数的主效基因[31]，其它基因的单个SNP并不能显著影响小尾寒羊产羔数，而对其它绵羊品种是否有影响需要进一步研究，但这也表明PER3基因的稳定表达对绵羊产羔数很重要。在具有产羔记录的380只中，并没有发现g.43670763C>T位点突变，一种可能是小尾寒羊并没有该位点突变，也可能是选择样品的数量还是不够大。

4 结 论

本研究发现在季节性发情的苏尼特羊中，PER3基因在松果体、下丘脑和垂体等繁殖相关组织的表达量均高于常年发情小尾寒羊，推测PER3基因很可能与绵羊季节性发情调控有关，且该基因的g.43657503A>G、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43677259T>C和g.43707227G>A 5个SNPs可能是与绵羊季节性发情相关的关键位点；PER3的SNPs与小尾寒羊产羔数性状并不显著关联，但在一定程度上能影响其产羔数。