长链非编码RNA SNHG5在重度子痫前期患者胎盘中的表达及其通过miR-155/CXCR4对滋养细胞侵袭的影响

杨志娟,张 媛,彭迎春,许洪梅,杨 洋,师增增

(1乐山市人民医院妇产科,乐山 614000;2西安医学院第一附属医院妇产科;3空军军医大学第二附属医院妇产科;*通讯作者,E-mail:87498009@qq.com)

子痫前期(preeclapmpsia,PE)是妊娠期常见特异性疾病,危及母儿安全[1],目前发病机制不清。PE时,由于滋养细胞增殖异常、侵袭障碍、凋亡增加,螺旋动脉重塑受损,引发后续病理性胎盘形成为主要学说[2]。PE是多因素、多机制及多通路引起的疾病;因此了解滋养细胞功能相关影响因素,对探究PE病因具有一定意义。

近年来的相关研究显示,部分长链非编码RNA(lncRNA)与PE相关,能够调节滋养细胞的侵袭和迁移[3]。lncRNA为长度超过200 nt且不能编码蛋白质的一类非编码RNA(ncRNA),能够参与细胞增殖、凋亡、血管生成和肿瘤转移等过程,还可以多种方式调控同为ncRNA属性的微小RNA(microRNA,miRNA),间接影响miRNA的靶基因发挥相关生理功能[4]。其中,lncRNA-SNHG5在黑色素瘤细胞中能够通过对miR-155发挥竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)作用,促进细胞增殖,抑制凋亡[5]。而miR-155与PE的相关性研究已较为深入,其在PE胎盘组织中病理性高表达[6];其靶基因CXCR4[7]在PE胎盘中病理性低表达,且能够影响滋养细胞侵袭性[8]。

因此,lncRNA-SNHG5是否与PE相关,该因子作为上游因子能否对miR-155发挥竞争性内源性RNA作用,改变miR-155的表达,抑制靶基因CXCR4从而减弱滋养细胞侵袭功能,参与PE的发病,值得探究。通过本研究,希望可以初步探索PE的发病机制,为临床对PE进行诊断或治疗提供理论基础;对患者、医疗机构及社会具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 胎盘组织采集

30例重度子痫前期(sPE组)与30例正常产妇(正常组)胎盘组织均收集自2018年10月至2019年6月于乐山市人民医院妇产科住院首次接受剖宫产分娩的患者。纳入标准:所纳入的两组产妇既往均无糖尿病、心脏病、慢性高血压、慢性肾炎、自身免疫疾病、血栓形成病症、精神疾病、阴道或剖宫产分娩史、胎儿畸形和HELLP综合征病史。sPE组按照第九版妇产科学诊断标准确诊为重度子痫前期的患者。

用灭菌PBS洗涤胎盘组织,立即在液氮中快速冷冻,在-80 ℃下储存备用。所有实验均经乐山市人民医院伦理委员会批准。所有纳入产妇均签署知情同意书。

1.2 细胞株及主要试剂

HTR8细胞购自美国ATCC公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Thermo公司;空质粒(pcDNA3.1)和SNHG5过表达质粒(pcDNA3.1-SNHG5)购自中国上海吉玛公司;siRNA(SNHG5抑制序列)、PCR引物购自中国广州瑞博公司;TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;PrimeScript RT Master Mix及PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒、SYBR Premix ExTaq试剂盒购自日本TaKaRa公司;Opti-MEM培养液及Lipofectamine2000试剂盒购自美国Invitrogen公司;Matrigel胶、Tanswell小室购自美国BD公司;SDS裂解液及蛋白定量试剂盒购自美国Invitrogen公司;小鼠抗人CXCR4单克隆抗体、小鼠抗人GAPDH单克隆抗体、二抗购自英国Abcam公司。

1.3 细胞培养与转染

常规复苏HTR8细胞,接种于含10%胎牛血清,100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640培养基,37 ℃、5% CO2无菌培养。取对数生长期HTR8细胞,按照Lipofectamine2000试剂盒说明书步骤,分别转染空质粒(pcDNA3.1)、SNHG5过表达质粒(pcDNA3.1-SNHG5)、siRNA(SNHG5抑制序列),分为:过表达组、抑制组和对照组(NC组)。每组设置5孔重复。转染后6 h,第一次细胞换液,培养24 h进行后续实验。

1.4 qRT-PCR检测胎盘组织lncRNA-SNHG5及转染后HTR8细胞中lncRNA-SNHG5、miR-155、CXCR4 mRNA的表达

按照TRIzol试剂盒说明步骤提取冻存sPE组、正常组胎盘组织及各转染组细胞总RNA,并检测RNA质量。根据PrimerBank公布的基因序列设计合成lncRNA-SNHG5、miR-155、CXCR4及内参U6、β-actin的引物序列,具体序列见表1。

表1 目的基因引物序列及PCR反应条件

使用PrimeScript RT Master Mix反转录合成lncRNA-SNHG5、CXCR4cDNA。使用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成MiR-155 cDNA。分别以U6、β-actin为内参,按照SYBR Premix ExTaq试剂盒说明行实时定量PCR反应。采用基于比较Ct法计算目的基因的相对表达水平。每次设定3个复孔,各重复3次。

1.5 Transwell检测转染后HTR8细胞的侵袭能力

将转染后的各组细胞接种在涂有Matrigel胶的Transwell(8 μm)的顶室上。细胞于上室中使用不含FBS的RPMI-1640培养基培养,下室装有含10%FBS的RPMI-1640培养基。培养24 h后,用70%乙醇固定侵入小室的细胞,并用0.1%结晶紫染色,并在光学显微镜下随机选择5个区域计数侵入细胞的数目。实验重复3次。

1.6 Western blot检测过表达与抑制miR-155后HTR8细胞中CXCR4蛋白的表达

通过使用SDS裂解溶提取各组细胞总蛋白,BCA测定试剂盒测量蛋白质浓度。通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离等量的蛋白质,然后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。将膜用5%脱脂乳在室温下封闭1 h,然后在4 ℃下与小鼠抗人CXCR4(1 ∶2 500)、小鼠抗人GAPDH(1 ∶1 500)单克隆抗体孵育过夜。将膜与HRP标记的二抗(1 ∶5 000)在室温下孵育1 h。使用化学发光检测系统(Thermo Fisher Scientific)检测目的蛋白印迹条带。目的蛋白的表达量以CXCR4/内参GAPDH比值表示。实验重复3次。

1.7 统计学分析

符合正态分布的计量资料以平均值±标准差表示。所有统计分析均使用SPSS19.0软件。使用Student’st检验或单因素ANOVA分析不同组间的差异。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-SNHG5在重度PE胎盘中的表达

sPE组和正常组产妇在年龄[(26.55±3.21)岁vs(25.98±3.77)岁],体质量指数[(27.13±3.51)kg/m2vs(27.98±3.12)kg/m2]、孕周(35.13±4.32vs36.98±2.78)方面无统计学差异(P>0.05)。qRT-PCR检测结果显示,与正常组相比,sPE组lncRNA-SNHG5表达水平降低(0.88±0.22vs0.61±0.20,F=4.626,P<0.01,见图1)。

与正常组比较,**P<0.01图1 lncRNA-SNHG5在正常与重度PE胎盘中表达水平Figure 1 Comparison of lncRNA-SNHG5 expression between normal tissue and severe PE placenta

2.2 转染后lncRNA-SNHG5 mRNA在各组HTR8细胞中的表达水平

qRT-PCR检测结果显示,与对照组相比,lncRNA-SNHG5 mRNA在过表达组HTR8细胞中表达水平显著增高,在抑制组中表达水平显著降低,以上差异有统计学意义(P<0.01,见图2)。

2.3 lncRNA-SNHG5对miR-155/CXCR4表达的影响

qRT-PCR检测结果显示,与抑制组相比,过表达组HTR8细胞转染pcDNA3.1-SNHG5后,miR-155表达水平降低(F=21.301,P<0.01,见图3);与抑制组相比,过表达组HTR8细胞中CXCR4 mRNA水平(F=50.18,P<0.01)和蛋白表达水平(F=79.08,P<0.01)均升高(见图3)。

与对照组比较,**P<0.01图2 lncRNA-SNHG5在HTR8细胞中的表达水平Figure 2 Expression of lncRNA-SNHG5 in HTR8 cells of each group

2.4 lncRNA-SNHG5对HTR8细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭试验结果显示,与对照组相比,过表达组细胞侵袭能力升高,抑制组细胞侵袭降低,差异有统计学意义(F=355.69,P<0.01,见图4)。

3 讨论

PE作为妊娠期特有疾病,发病率较高,严重威胁母婴健康。其病因尚未完全明确,螺旋动脉重铸不足,血管内皮细胞损伤、炎症、遗传等均与之相关;滋养细胞侵袭功能的下降可导致子宫螺旋动脉重塑障碍、胎盘浅着床已被认为是PE发病机制的重要过程[9]。目前,已有诸多研究明确了PE妊娠胎盘组织中差异表达的非编码RNA(包括miRNAs、lncRNAs),这些非编码RNA能够介导滋养细胞功能发生变化,可能参与了PE发病过程[2,10]。本研究显示,与正常晚孕胎盘组织相比,lncRNA-SNHG5在重度PE患者胎盘组织中呈病理性低表达(P<0.05)。lncRNA-SNHG5与直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌等肿瘤密切相关,通过调控肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡等[11],参与疾病过程。但目前SNHG5与妊娠相关疾病的报道不多,且lncRNA参与疾病的相关具体机制仍需进一步探究。

与对照组比较,**P<0.01;与抑制组比较,##P<0.01图3 HTR8细胞中miR-155、CXCR4 mRNA及蛋白的表达水平Figure 3 Expression of miR-155, CXCR4 mRNA and protein level in HTR8 cells in each group

与对照组比较,**P<0.01;与抑制组比较,##P<0.01图4 lncRNA-SNHG5对HTR8细胞侵袭能力的影响Figure 4 Effect of lncRNA-SNHG5 on invasive ability of HTR8 cells in each group

基因组测序项目表明,人类基因组中有超过90%的基因组被转录为非编码RNA,而lncRNA与miRNA作为最为重要的两类非编码RNA,除外能够通过影响基因、表观遗传学等参与调节多种生理过程外,这两者间还能够通过竞争结合、“海绵效应”等方式[12,13],相互关联,互相影响,共同构成了一个精细、复杂、值得探究的调控网络。黑色素瘤细胞中lncRNA-SNHG5与miR-155之间的负向调控关系已得到验证[5],SNHG5能够通过对miR-155发挥ceRNA作用,间接影响相关细胞功能。本研究利用细胞平台,在人滋养细胞HTR8中通过转染实验,对lncRNA-SNHG5进行过表达与抑制后,显示miR-155表达出现了负性调控(P<0.05),这与Yan等[5]的研究结果一致。

miR-155可通过靶向调控CXCR4表达影响滋养细胞侵袭、迁移[8]。而本研究提示lncRNA-SNHG5与PE相关。在人滋养细胞系中,lncRNA-SNHG5可负向调控miR-155的表达。在此基础上,本课题组进一步进行了Transwell侵袭试验,证明过表达SNHG5后HTR8细胞侵袭能力升高(P<0.05);抑制其表达,则HTR8细胞侵袭力降低(P<0.05)。虽然研究结果显示,lncRNA-SNHG5表达下降可导致滋养细胞侵袭力下降,这中间介导机制还不明确。故本课题对miR-155靶基因CXCR4表达进行深入分析,显示SNHG5表达减弱后HTR8细胞中CXCR4在mRNA及蛋白水平均下降(P<0.05),这与张展等[14]的发现具有一致性。该结果提示lncRNA-SNHG5通过负向调控miR-155，进一步影响CXCR4表达，可能是其导致滋养细胞侵袭力下降的相关机制。

CXCR4作为基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF1)的特异性受体,广泛存在于母胎界面重要组织细胞中[15](胎盘滋养细胞、蜕膜自然杀伤细胞、血管内皮细胞中均有表达);CXCR4与miR-155在3′ UTR端具有互补结合的种子序列[7],有负性调控关系;CXCR4通过与SDF1的结合[16],在母胎界面中调控其下游相关通路,发挥交互作用,影响滋养细胞侵袭功能。PE时CXCR4/SDF1的失衡,进而影响滋养细胞侵袭力异常、胎盘浅着床的部分机制已得到验证[17]。根据本研究结果显示:PE相关lncRNA-SNHG5过表达可能对miR-155发挥了ceRNA样作用,内源性竞争性结合并吸附miR-155,导致miR-155的表达被抑制;继而间接降低了miR-155对CXCR4的负性调控,致使CXCR4表达增高,解除了miR-155对滋养细胞侵袭能力的抑制作用,使HTR8细胞侵袭力提高。反之,当lncRNA-SNHG5被抑制时,通过上述机制导致HTR8细胞侵袭力降低。后续lncRNA-SNHG5与miR-155在滋养细胞中竞争性结合的靶点,以及在HTR-8细胞中具体的结合部位、相关机制,还需进一步探讨。

综上,研究结果显示子痫前期患者胎盘中lncRNA-SNHG5表达下降,可能通过影响miR-155/CXCR4途径导致滋养细胞侵袭能力下降,可能是PE发病的潜在机制,这有待进一步探索。而新近研究表明[18],lncRNA已经具有了作为PE早期诊断与治疗靶点的潜在可能;因此,本研究为后续探究PE病因机制,丰富PE的诊治手段提供了新的思路和基础。