ISG15真核表达载体的构建及鉴定

万新星，陈汉春

（1. 中南大学湘雅三医院内分泌科，长沙 410013；2. 中南大学生命科学学院生物化学与分子生物系，长沙 410013）

ISG15干扰素刺激基因15（Interferon stimulated gene 15）的表达产物能被干扰素（interferon，IFN）诱导并大量表达。ISG15在其激活酶、转移酶和连接酶的协助下，通过靶向修饰蛋白质发挥功能。因其结构和功能与泛素十分类似，又被称为类泛素蛋白质［1］。ISG15具有很强的抗病毒能力，能抑制乙型流感病毒、埃博拉病毒、人类免疫缺陷病毒等多种病毒复制或释放，是抑制病毒的关键因子［2-4］。ISG15与肿瘤的发生发展密切相关，在肺癌、前列腺癌等许多恶性肿瘤中高表达，能通过多条通路调控肿瘤的发生，但其机制尚未清楚［5-8］。前期研究发现白血病K562细胞在IFN-α联合作用下增殖受抑，且蛋白质组学分析发现IFN-α诱导后的K562细胞ISG15增加，在干扰素诱导后的白血病KT1-A3细胞株中发现ISG15蛋白增加并伴有明显凋亡；全反式维甲酸RA也能诱导ISG15，并且在临床上能有效缓解白血病症状。为研究ISG15在肿瘤发生发展过程中的功能，我们试图构建PCDNA3.1（+）-ISG15载体，以期进一步研究ISG15在肿瘤调控过程中的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养KT1/A3细胞复苏后置于5 mL含有10%胎牛血清（杭州四季青有限责任公司）、100 U/mL双抗（青霉素及链霉素）的RPMI-1640（美国GIBCO公司）培养基中，在37℃、5% CO2及饱和湿度的恒温培养箱中，根据细胞生长状况每2～3天继续传代。

1.2 PCDNA3.1（+）-ISG15载体构建KT1/A3细胞加入1000 U/mL IFN-α（美国Sigma公司），培养48 h后在无菌操作台中TRIZOL法提取总RNA并逆转录，利用primer5.0软件设计的ISG15上游引物isg15-F1及下游引物isg15-R1进行PCR扩增（详细序列见表1）。扩增后的PCR产物纯化后，与空载体PCDNA3.1（+）进行KpnI、BamHI（美国life公司）双酶切。再次纯化后通过T4连接酶于16℃ 2 h后4℃过夜连接。连接后的质粒转化至DH5α感受态细胞，吸取转化后的DH5α菌液小心滴在有Amp抗性的LB平板上，均匀涂抹后置于37℃生化培养箱培养过夜，观察是否有菌落长出，并在超净台中用接种环挑取单克隆菌落进行下一步实验。

表1 本研究使用的ISG15扩增上游引物及下游引物序列

1.3 PCDNA3.1（+）-ISG15载体鉴定平板上单克隆菌落用接种环小心挑取后，在超净台中小心接种于含60 mg/L Amp的LB培养基，37℃振荡过夜，待LB培养基浑浊后停止培养并提取质粒。所提取质粒经KpnI、BamHI双酶酶切后进行琼脂糖电泳，将目的大小片段切胶回收后进行测序鉴定。

2 结果

2.1 人源细胞总RNA提取白血病细胞株KT1/A3细胞经不同处理后分别培养48 h，Trizol法提取总RNA，点样于0.8%琼脂糖凝胶，100 V电泳45 min后将凝胶取出并拍照，凝胶成像系统中可见三条清晰的rRNA带：28S、18S和5.8S+5S（图1），其中28 S：18 S约为2：1。

图1 KT1/A3细胞总RNA提取

2.2 RT-PCR扩增isg15基因逆转录IFN-α处理组的细胞总RNA，用isg15特异性引物PCR扩增，所得PCR产物点样于琼脂糖凝胶，100 V电泳后检测isg15基因片段。凝胶成像系统拍照可见600 bp处有单一明亮isg15条带（图2）。

2.3 穿梭载体PCDNA3.1（+）-ISG15构建利用KpnI及BamHI 双酶切PCDNA3.1（+）质粒及isg15基因片段，将双酶切产物按照摩尔比1：10的比例混合，通过连接、转化、单克隆菌落挑取等实验成功获得PCDNA3.1（+）-ISG15穿梭载体。将所得穿梭载体与对照空载体PCDNA3.1（+）再次用KpnI、BamHI进行双酶切，其产物用琼脂糖凝胶电泳检测。图3初步确认穿梭载体PCDNA3.1（+）-ISG15构建成功，但仍需进一步基因测序验证。

图2 RT-PCR扩增isg15基因

图 3 穿梭载体的双酶切

2.4 穿梭载体PCDNA3.1（+）-ISG15测序将所得PCDNA3.1（+）-ISG15穿梭载体进行基因测序，结果如图4所示：其中黄色标记为起始密码子ATG与终止密码子TAA。利用BLAST比对测序所得序列，发现序列中有一处同义突变（方框处），编码框中碱基序列由GTA突变为GTG，因鉴定后发现这两种密码子都编码缬氨酸，对编码的ISG15蛋白质氨基酸序列并无改变，证明穿梭载体PCDNA3.1（+）-ISG15构建成功（图5）。

图4 PCDNA3.1（+）-ISG15测序结果起始密码子ATG及终止密码子TAA用黄色标记

图5 BLAST比较构建isg15序列方框处为同义突变

3 讨论

ISG15是第一个被鉴定的类泛素蛋白质，能够靶向修饰多种蛋白质，参与并调控多种生理功能。目前研究发现ISG15在抗病毒、自身免疫调节、肿瘤发生等反应中都发挥着重要作用，被认为是IFN的关键效应因子［9］。ISG15在自身免疫调节、肿瘤发生中的具体作用机制尚未明确，现有研究发现ISG15在许多肿瘤中高表达，通过NF-κB通路或泛素化途径调控肿瘤发生，但仍需要进一步深入研究。为进一步探索ISG15在肿瘤中的功能，本研究构建了人源PCDNA3.1（+）-ISG15穿梭载体，可用于ISG15的功能研究，为进一步研究ISG15在肿瘤发生发展过程中的机制奠定了实验基础。