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黄连膏提取工艺优化及其体外抗炎活性

2020-09-15王远茜王思明赵大庆

中成药 2020年8期
关键词:货号姜黄黄连

王远茜 韩 冰 王 丹 王思明 李 娜* 赵大庆*

(1.长春中医药大学, 吉林长春130117; 2.长春金赛药业股份有限公司, 吉林长春130012)

黄连膏出自清代吴谦的《医宗金鉴》,是用于治疗皮肤创面疾病的中医经典名方,原配方为当归尾五钱、黄连三钱、黄柏三钱、生地一两、姜黄三钱,按照清代度量衡制度结合2015 年版《中国药典》 计量单位,将其换算为黄连11.175 g、当归尾18.625 g、生地黄37.250 g、黄柏11.175 g、姜黄11.175 g,总生药量89.4 g。方中姜黄破血行气,当归活血养血,生地清热生津、凉血养阴润燥,黄连清热燥湿,黄柏泻火解毒[1],攻效清热疖肿、清热解毒、溃疡创伤,主要用于治疗肺经壅热、上攻鼻窍,致生鼻疮、干燥肿疼等,对皮肤湿疹、水火烫伤、红肿热疮、乳头碎痛也有理想疗效。近年来,该方在治疗新生儿红臀、痔疮、烧烫伤、压疮、粉刺等也呈现了良好作用,堪称中医外科之“圣药”[2⁃3]。

黄连膏以清利湿热为组方原则,对湿疹的治疗有着悠久历史[4]。湿疹是由多种因素引起真皮浅层、表皮炎症的皮肤病,目前市面上常用药物以西药为主,但大多含有激素类成分,具有较大的不良反应;中药膏剂治疗湿疹具有不良反应小、疗效好、不易复发的优势,可通过皮肤涂抹使药物直达病所,不仅能透达腠理来发挥局部治疗作用,还可经过肌肤、毛窍而深入脏腑,从而起到内外合治的目的[5⁃6]。本实验将优化黄连膏提取工艺,并选择人永生化角质形成细胞(HaCat 细胞) 作为对象对该方体外抗炎作用进行研究,以期为今后相关机制的考察提供依据。

1 材料

1.1 仪器 细胞培养箱(美国Thermo 公司,型号3131);酶标仪 (瑞士Tecan 公司,型号infinite M200 PRO);电子天平(瑞士梅特勒⁃托利多公司,型号AL204);粉碎机(北京锟捷玉诚机械设备有限公司,型号GS⁃05);高效液相色谱仪 (美国Agilent 公司,型号1100)。

1.2 试剂与药物 姜黄、当归、生地、黄连、黄柏均购自宏检大药房,经长春中医药大学中药鉴定学教研室王哲副教授鉴定为正品。香油 (燕庄牌)。MEM 培养基 (美国HyClone 公司,货号SH30022.01);胎牛血清 (货号04⁃002⁃1ACS)、1%双抗(货号03⁃031⁃1B)(美国BI 公司);0.25%胰 酶⁃EDTA (美 国 MRC 公 司,货 号CC830031.02);MTT 试剂盒(北京Solarbio 公司,货号M8180);反转录试剂盒(日本TaKaRa 公司,货号PR047A);TRIzol (美国罗氏公司,货号11667165001);人肿瘤坏死因子⁃α (TNF⁃α)、人干扰素⁃γ (IFN⁃γ) 细胞因子(美国Biolegend 公司,货号300⁃01A⁃10、300⁃02⁃20);胸腺活化调节趋化因子 (TARC)、巨噬细胞源性趋化因子(MDC)、调节活化T 细胞表达和分泌因子(RAN⁃TES)、白细胞介素⁃8 (IL⁃8) ELISA 试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司,货号 BPE10052、BPE10132、BPE10120、BPE10139)。

1.3 细胞株 人正常表皮永生化角质形成细胞系HaCat 细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 姜黄素总量测定 姜黄为黄连膏君药,其药理作用广泛,无毒,耐受性好,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用[7],主要有效成分为姜黄素,在治疗炎症介导的疾病中有着重要地位,并且《中国药典》 相关检测方法实用性强,易于操作。因此,本实验选择姜黄素作为指标成分[8]。

2.1.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),填充剂十八烷基硅烷键合硅胶;流动相乙腈-4% 冰醋酸 (48 ∶52);体积流量1 mL/min;检测波长430 nm;进样量5 μL。理论塔板数按姜黄素峰计算,应不低于4 000[9]。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取姜黄素对照品1.20 mg,甲醇制成每1 mL 含12 μg 该成分的溶液,摇匀,即得。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取黄连膏提取油5.0 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入20 mL 甲醇,称定质量,75 ℃水浴加热回流提取30 min,放冷,甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5 μL,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以姜黄素进样量为横坐标(X),峰面积积分值为纵坐标(Y) 进行回归,得方程为Y=3 509.2X-3.293 3 (r=0.999 8),在0.036~0.216 μg 范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密称取黄连膏提取油5.0 g,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次,每次5 μL,测得姜黄素峰面积RSD 为0.56%,表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 吸取同一份供试品溶液,于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,每次5 μL,测得姜黄素峰面积RSD 为0.72%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取同一批黄连膏提取油6 份,每份5.0 g,按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液,各吸取5 μL,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得姜黄素总量RSD 为1.28%,表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取黄连膏提取油5.0 g,共6 份,精密加入等量对照品溶液,按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1.1”项色谱条件下进样测定,测得姜黄素平均加样回收率为99.1%,RSD 为0.51%。

2.2 提取工艺优化 依据《医宗金鉴》 提取工艺,取香油十二两(即加入5 倍量香油,每个处方447 g),将药“煠枯” 后捞去渣,选择药材粒度、煎炸时间、煎炸温度、浸泡时间作为影响因素,姜黄素总量作为评价指标,在前期单因素试验基础上采用正交试验优化工艺[10]。因素水平见表1,结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

方差分析见表3,可知因素B、C对提取有显著影响 (P<0.05),而因素A、D无显著影响(P>0.05);各因素影响程度依次为B>C>A>D,故确定D作为误差项。由表2 可知,最优工艺为A1B2C2D2,为了节省成本,缩短生产周期,最终确定为A1B2C2D1,即饮片不浸泡而直接投入5 倍量香油中,200 ℃下煎炸4 h。

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

再进行3 批验证试验。按处方取10 倍量饮片,共3 份,按上述优化工艺提取,捞出炸枯的药渣,滤过,测定提取油质量和姜黄素总量,结果见表4,可知工艺稳定可靠。

表4 验证试验结果(n=3)Tab.4 Results of verification tests (n=3)

2.3 体外抗炎活性研究

2.3.1 细胞培养及模型建立 采用含1% 双抗、15%胎牛血清的MEM/EBSS 液体培养基,将HaCat细胞置于25 cm2培养瓶中,在饱和湿度培养箱(37 ℃、5%CO2) 中培养,24 h 后更换培养液,除去未贴壁细胞,每隔1~2 d 更换1 次培养液至细胞生长融合,待细胞贴壁达到70%~80% 时,用0.25%EDTA⁃胰蛋白酶消化液消化细胞,并进行传代[11]。

由于血清可诱导细胞因子的分泌,从而影响体外湿疹模型的建立,故采用血清饥饿法建立体外湿疹炎症模型[12]。取对数生长期的HaCat 细胞,按每孔4 000 个细胞量均匀接种于96 孔板中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后换无血清空白培养基饥饿细胞6 h,再更换含有不同造模浓度细胞因子的培养基中培养24 h。设置空白培养基组、10 ng/mL TNF⁃α +10 ng/mL IFN⁃γ 组、20 ng/mL TNF⁃α +20 ng/mL IFN⁃γ 组、30 ng/mL TNF⁃α +30 ng/mL IFN⁃γ 组、40 ng/mL TNF⁃α +40 ng/mL IFN⁃γ 组,每组设6 个副孔,培养结束后加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL,置于37 ℃培养箱中培养4 h 后吸去培养基,每孔加入150 μL DMSO,酶标仪在490 nm 波长处检测光密度(OD),计算细胞存活率,公式为存活率=OD药物/OD空白×100%,筛选LD50时的造模浓度[13]。

采用重复测量设计的方差分析,发现不同造模浓度TNF⁃α、IFN⁃γ 对HaCat 细胞存活率影响的差异有统计学意义(P<0.05),并随着造模浓度升高而逐渐降低(P<0.05)。图1 显示,当造模浓度为20 ng/mL 时,细胞存活率为50%,即为LD50。

图1 造模浓度对HaCat 细胞存活率的影响Fig.1 Effect of modeling concentration on the survival rate of HaCat Cells

2.3.2 细胞毒性试验 0.25% EDTA⁃胰蛋白酶消化HaCat 细胞后,MEM 完全培养基吹打稀释成浓度为4×104/mL 的细胞悬液,以每孔100 μL 的体积加到96 孔板中,置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。细胞贴壁后弃去完全培养基,加入空白培养基饥饿培养6 h,再加入含0.05、0.5、1、2 μL/mL黄连膏提取油的MEM 空白培养基各100 μL,以MEM 空白培养基为空白对照组[14],每组平行设置6 个副孔,作用24 h 后每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL,继续培养4 h,弃去原培养液,加入150 μL DMSO 溶解,振荡3 min 使结晶物充分溶解,在490 nm 波长处检测吸光度(OD),计算细胞存活率,结果见图2。由此可知,提取油浓度为2 μL/mL 时对细胞生长有抑制作用(P<0.01),存活率为77%,而在0.05~1 μL/mL时无细胞毒性,故最终选择0.05、0.5、1 μL/mL作为实验浓度。

图2 黄连膏提取油对HaCat 细胞存活率的影响Fig.2 Effect of Huanglian Ointment extract oils on the survival rate of HaCat cells

2.3.3 TARC、MDC、RANTES、IL⁃8 水平检测 取对数生长期的HaCat 细胞,接种于6 孔板中(每孔7×104个) 培养24 h,待细胞贴壁后更换无血清培养基饥饿细胞4 h,弃去空白培养基,以MEM 空白培养基为空白对照组,加入含“2.3.1”项造模浓度TNF⁃α、IFN⁃γ 及0.05、0.5、1 μL/mL黄连膏提取油的无血清培养基,处理细胞24 h,收集每孔上清培养基,1 000 r/min 离心5 min 以去除细胞碎片,ELISA 法检测上清培养基中TARC、MDC、RANTES、IL⁃8 水平[15]。图3 显示,TNF⁃α、IFN⁃γ 处理HaCat 细胞后TARC 水平高于空白对照组(P<0.05),而黄连膏提取油对其水平有较强的抑制作用,并呈剂量依赖性(P<0.01)。

图3 黄连膏提取油对TARC 水平的影响Fig.3 Effect of Huanglian Ointment extract oils on TARC level

图4 显示,TNF⁃α、IFN⁃γ 处理HaCat 细胞后MDC 水平高于空白对照组(P<0.05),而黄连膏提取油对其水平有较强的抑制作用 (P<0.05,P<0.01),以1 μL/mL 更明显。

图4 黄连膏提取油对MDC 水平的影响Fig.4 Effect of Huanglian Ointment extract oils on MDC level

图5 显示,TNF⁃α、IFN⁃γ 处理后RANTES 水平高于空白对照组(P<0.05),而1 μL/mL 黄连膏提取油对其水平有较强的抑制作用(P<0.01)。

图5 黄连膏提取油对RANTES 水平的影响Fig.5 Effect of Huanglian Ointment extract oils on RANTES level

图6 显示,TNF⁃α、IFN⁃γ 处理后IL⁃8 水平高于空白对照组 (P<0.05),而 0.05、0.5、1 μL/mL黄连膏提取油对其水平有较强的抑制作用(P<0.01)。

图6 黄连膏提取油对IL⁃8 水平的影响Fig.6 Effect of Huanglian Ointment extract oils on IL⁃8 level

3 讨论

传统上,皮质类固醇(软膏、乳膏或注射剂)被认为是治疗湿疹最有效的方法[16],但其长期应用会引起不良反应,导致临床上受到限制[17⁃18],故迫切需要开发相关新型药物。湿疹发病机制与角质形成细胞作用的失调有关,促炎细胞因子对后者的刺激可引起炎性趋化因子产生,可专门用于招募效应细胞(如单核细胞、粒细胞、T 淋巴细胞),从而促进皮损炎症反应的发展[19⁃20]。

本实验采用正交试验对黄连膏提取工艺进行优化,发现各因素对姜黄素总量的影响程度依次为煎炸时间>煎炸温度>药材粒度>浸泡时间,其中煎炸时间、煎炸温度更显著;由直观分析结果可知,最优提取工艺为将药材饮片直接投入5 倍量香油中,200 ℃下煎炸4 h。验证试验显示,该工艺准确度高,稳定可行,具有实际利用价值,可使古方工艺中的“将药煠枯” 操作标准化,为经典名方黄连膏的新剂型开发打下坚实基础。

体外抗炎活性实验结果表明,炎性趋化因子TARC、MDC 水平随着黄连膏提取油浓度升高而降低,并呈现剂量依赖性,同时高浓度(1 μL/mL)下IL⁃8、RANTES 水平基本恢复正常。由此可知,黄连膏可明显抑制炎症介质释放,减轻表皮细胞炎症反应,促进皮肤屏障恢复[21]。

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