HPLC 法同时测定紫白栓中9 种成分

2020-09-15吴学辉程心玲潘艳琳

中成药 2020年8期

吴学辉肖钦肖淋程心玲潘艳琳

（福建中医药大学附属人民医院药学部，福建福州350004）

紫白栓为福建中医药大学附属人民医院制剂紫白膏（闽药制字Z06106031）改进而来，由紫草、大黄、白及、煅石膏、冰片5 味药材组成，主要用于内外痔、肛裂、肛周炎之血热证等病症的治疗，可有效防治混合痔术后便时出血［1⁃2］，更快减轻肛缘水肿和疼痛症状［3⁃5］；通过刺激血管内皮增长因子的表达来诱导血管新生，改善局部组织的缺血状态，促进手术创面的愈合［6⁃8］；有效缓解湿热下注型肛裂术后肛门局部疼痛［9］，具有良好的临床应用价值，但其现行标准仅有药味TLC 定性鉴别及栓剂通则项检查。因此，本实验采用HPLC 法同时测定紫白栓中紫草所含乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素，大黄所含芦荟大黄素、大黄素甲醚，白及所含贝母兰宁、山药素Ⅲ的含有量，以期为提高其质量分析水平、完善其质量控制标准、全面评价其内在质量提供参考依据。

1 材料

Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；MS103DU 型电子分析天平（瑞士Mettler⁃Toledo 公司）。β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁（批号111689⁃201805，CAS 号34539⁃65⁃6，纯度98.0%）、芦荟大黄素（批号110795⁃201710，CAS 号481⁃72⁃1，纯度 98.3%）、大黄素甲醚（批号 110758⁃201817，CAS号521⁃61⁃9，纯度99.2%）对照品均购于中国食品药品检定研究院；贝母兰宁（批号CFS201801，CAS 号82344⁃82⁃9，纯度98.0%）、山药素Ⅲ（批号CFS201802，CAS 号56684⁃87⁃8，纯度98.0%）对照品均购于武汉天植生物技术有限公司；乙酰紫草素（批号16030121，CAS 号24502⁃78⁃1，纯度99.7%）、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁（批号14071422，CAS 号69091⁃17⁃4，纯度99.9%）、异戊酰紫草素（批号18040322，CAS 号76549⁃35⁃4，纯度98.0%）对照品均购于上海同田生物技术股份有限公司；异丁酰紫草素（批号Y⁃189⁃170410，CAS 号52438⁃12⁃7，纯度98.0%）对照品购于成都瑞芬思生物科技有限公司。紫白栓（每粒重1.7 g，批号190805、190812、190827）来源于福建中医药大学附属人民医院。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液精密称取各对照品适量，70%甲醇制成含贝母兰宁0.152 mg／mL、山药素Ⅲ0.318 mg／mL、乙酰紫草素0.796 mg／mL、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁0.374 mg／mL、异丁酰紫草素0.292 mg／mL、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁0.434 mg／mL、异戊酰紫草素0.932 mg／mL、芦荟大黄素0.258 mg／mL、大黄素甲醚0.112 mg／mL 的贮备液，各精密吸取2.5 mL，置于50 mL 量瓶中，70% 甲醇稀释，即得（各成分质量浓度分别为7.6、15.9、39.8、18.7、14.6、21.7、46.6、12.9、5.6 μg／mL）。

2.1.2 供试品溶液取栓剂适量，剪碎，混匀，精密称取2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇［10⁃11］，密塞，称定质量，加热回流提取30 min，取出，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.1.3 阴性样品溶液按栓剂处方工艺，分别制备缺白及、缺紫草、缺大黄的阴性样品，按“2.1.2” 项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） ⁃0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～11.0 min，40.0%A；11.0～20.0 min，40.0%～55.0% A；20.0～48.0 min，55.0%～76.0% A；48.0～62.0 min，76.0%～85.0% A；62.0～70.0 min，85.0%～40.0%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长275 nm （0～48.0 min，贝母兰宁、山药素Ⅲ、乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素［12⁃17］）、254 nm （48.0～70.0 min，芦荟大黄素、大黄素甲醚［12，18］）；进样量10 μL。

2.3 专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，色谱图基线平稳，各成分与其他杂质峰均能达到有效分离（分离度均＞1.5），理论塔板数均不低于4 500，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察精密量取“2.1.1” 项下贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于20 mL 量瓶中，70%甲醇稀释，在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验

2.5.1 日内精密度精密吸取“2.3” 项下对照品溶液，同一天内在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得贝母兰宁、山药素Ⅲ、乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素、芦荟大黄素、大黄素甲醚峰面积RSD 分别为1.15%、0.97%、0.83%、1.02%、1.21%、0.58%、0.43%、1.19%、0.92%，表明该方法日内精密度良好。

2.5.2 日间精密度精密吸取“2.3” 项下对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定3 d，测得贝母兰宁、山药素Ⅲ、乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素、芦荟大黄素、大黄素甲醚峰面积RSD 分别为1.46%、1.15%、0.98%、1.24%、1.59%、0.71%、0.55%、1.47%、1.06%，表明该方法日间精密度良好。

2.6 重复性试验取同一批栓剂（批号190805）适量，按“2.1.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得贝母兰宁、山药素Ⅲ、乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素、芦荟大黄素、大黄素甲醚含有量RSD 分别为1.83%、0.65%、1.43%、1.62%、0.68%、0.55%、1.09%、1.74%、0.89%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得贝母兰宁、山药素Ⅲ、乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素、芦荟大黄素、大黄素甲醚峰面积RSD 分别为1.23%、0.91%、0.75%、0.83%、1.05%、0.68%、0.59%、1.13%、1.29%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验取各成分含有量已知的同一批栓剂（批号190805）适量，剪碎，混匀，精密称取9 份，每份1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入含贝母兰宁0.084 mg／mL、山药素Ⅲ0.216 mg／mL、乙酰紫草素0.482 mg／mL、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁0.246 mg／mL、异丁酰紫草素0.198 mg／mL、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁0.284 mg／mL、异戊酰紫草素0.652 mg／mL、芦荟大黄素0.176 mg／mL、大黄素甲醚0.062 mg／mL 的对照品溶液0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，使各成分对照品加入量分别约为样品原有量的50%、100%、150%，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，贝母兰宁、山药素Ⅲ、乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素、芦荟大黄素、大黄素甲醚平均加样回收率分别为98.91%、99.16%、100.03%、98.49%、97.91%、97.80%、99.91%、96.98%、98.65%，RSD 分别为0.98%、1.08%、0.83%、1.64%、1.13%、1.22%、0.72%、1.11%、0.81%。

2.9 样品含有量测定取3 批栓剂，按“2.1.2”项下方法制备3 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 讨论

3.1 指标成分筛选在紫白栓组成药材中，乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素为紫草代表性成分，芦荟大黄素、大黄素甲醚为大黄代表性成分，贝母兰宁、山药素Ⅲ为白及代表性成分。本实验选取上述9 种成分作为指标，可更全面地评价紫白栓整体质量。

3.2 流动相筛选本实验考察了甲醇⁃0.1% 磷酸［12，18］、乙腈⁃0.1% 磷酸［11，14］、乙腈⁃0.1% 甲酸［10，13，15⁃17］，发现以乙腈⁃0.1%甲酸洗脱时各成分色谱峰峰形良好，分离度符合要求，基线平稳，进而对该流动相比例不断进行摸索，最终确定为“2.2” 项下梯度洗脱程序。

3.3 供试品溶液制备方法筛选本实验考察了提取溶剂（95% 乙醇［13］、甲醇［14⁃15，18］、70% 甲醇［10⁃11］）、提取方式（加热回流提取、超声提取［10⁃11，14⁃18］）、提取时间（15、30、60 min），发现以70%甲醇为提取溶剂时各成分综合提取效果最佳；加热回流提取效果优于超声提取；提取30 min时各成分即可提取完全，杂质干扰程度明显小于提取60 min 时，同时对提取溶剂用量不断进行摸索。最终确定，供试品溶液制备方法为25 mL 70%甲醇加热回流提取30 min。

3.4 检测波长筛选采用二极管阵列检测器，在190～400 nm 范围内对各成分对照品溶液进行全波长扫描，发现贝母兰宁、山药素Ⅲ分别在274.5、270.0 nm 处有较大吸收，乙酰紫草素、β⁃乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′⁃二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素均在275 nm 附近有较大吸收，芦荟大黄素、大黄素甲醚均在254 nm 处有较大吸收。同时，参考2015 年版《中国药典》紫草、大黄药材项［12］及文献［13⁃18］报道，分别选取275、254 nm 进行研究，发现单一波长难以同时对各成分进行检测，通过不断摸索，最终确定为“2.2” 项下检测波长。