芒果苷与别嘌醇长期毒性比较研究

林 华 候 亮 高丽辉 李 玲 牛艳芬

昆明医科大学生物医学工程研究中心，云南 昆明 650500

芒果苷是芒果叶中的主要活性成分，可从百合科植物知母中提取，也可从漆树科植物东北龙胆、川西獐牙菜，水龙骨科植物光石韦等中提取得到，资源非常丰富，国内外学者对芒果苷的药理活性进行了较为广泛地研究，发现芒果苷具有镇咳、祛痰、调节免疫、抗炎、保肝利胆、抗脂质过氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗糖尿病等多种药理活性[1-2]。在前期研究中本课题组发现芒果苷具有口服降尿酸的作用，且其降尿酸作用与别嘌醇相当，其主要的作用机制与抑制嘌呤代谢的关键酶黄嘌呤氧化酶有关，类似于别嘌醇[3]。别嘌醇作为抑制尿酸生成的代表性药物，半个多世纪以来一直是临床上降尿酸和抗痛风的主要药物，别嘌醇通过抑制黄嘌呤氧化酶，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转化为尿酸，减少尿酸生成，进而降低血尿酸[4]。别嘌醇在临床主要应用于原发性和继发性高尿酸血症以及痛风患者，但其在临床使用中存在过敏、胃肠道不适、肝肾损伤及骨髓抑制等不良反应。小鼠对芒果苷灌胃给药的最大耐受量为25.0g/kg，远远大于降尿酸药物别嘌醇和苯溴马隆，显示出高效、低毒的特点[5]。据此，笔者拟进行芒果苷和别嘌醇的毒性比较研究，探讨其长期毒性反应程度、毒作用靶器官和毒性反应的病理变化，以期为今后的研究工作提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD大鼠，来源于昆明医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(滇)K2015-0002，室温为(25±2) ℃，相对湿度 60%～70% 。动物实验研究获得昆明医科大学实验动物伦理委员会批准，编号：KYLL20190123。

1.1.2 主要试剂 芒果苷(陕西森弗生物技术有限公司，纯度 90.0% ，批号 20181103)；别嘌醇(广东彼迪药业有限公司，批号：20180901)。天门冬氨酸转移酶试剂盒(北京中生生物技术有限公司，批号：20100721)；丙氨酸转移酶试剂盒(北京中生生物技术有限公司，批号：20100721)；葡萄糖试剂盒(北京中生生物技术有限公司，批号：20100721)；尿素氮试剂盒(北京中生生物技术有限公司，批号：20100721)；肌酐试剂盒(北京中生生物技术有限公司，批号：20100721)；甘油三脂(北京中生生物技术有限公司，批号：20100721)。

1.2 方法

1.2.1 分组和给药 适应性饲养后，40只SD大鼠按性别随机分为4组，即：溶媒对照组、芒果苷高低剂量组(1000、300 mg/kg)和别嘌醇组(360 mg/kg)，每组10只，雌雄各半[6]。各组灌胃给予不同剂量芒果苷、别嘌醇和等量溶媒，每天给药1次，给药体积为10 mL/kg，连续给药4周后麻醉处死，进行血液学、血清生化和组织病理学的检测。

1.2.2 大鼠一般外观体征 给药期间每天观察动物外观体征、行为活动、皮毛、五官、外生殖器及粪便性状等，以及给药期间大鼠的毒性反应和致死情况。

1.2.3 体重和摄食量 每周称1次动物体重，根据体重变化调整动物给药量。每周记录摄食量，并计算各组雌雄动物的日均摄食量。

1.2.4 脏器重量与系数 试验结束时，取大鼠肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺分别称重，根据动物体重计算出脏器系数。公式：

1.2.5 血液学检测 试验结束时，将大鼠麻醉后腹主动脉取血500～600 μL，加1.25% EDTA-K2 50 μL抗凝，用漩涡震荡器混匀，取抗凝全血进行检测。

1.2.6 血清生化学检测 试验结束时，将大鼠麻醉后腹主动脉取血3～5 mL，常温静置20 min后，离心，取血清进行生化学检测。

1.2.7 病理组织学检查 试验结束时对试验动物进行系统解剖，肉眼观察各组大鼠的外观状态，详细记录观察结果，同时取大鼠胃、肠、十二指肠、肠系膜淋巴结、胰腺、肝、肾等脏器、组织置于10%甲醛溶液中固定，切片、HE染色，进行组织病理学检查。

1.2.8 实验数据处理 所有数据用表示，计量资料采用SPSS12.0软件进行方差分析，方差不齐用秩和检验；病理检查计数资料采用秩和检验。

2 结果与分析

2.1 芒果苷和别嘌醇对大鼠一般症状和死亡率的影响 溶媒对照组和芒果苷高低剂量组大鼠活动自如，毛发顺滑，饮食排便正常，未出现死亡情况；别嘌醇组的大鼠给药期间出现精神萎靡、少动、稀便。别嘌醇组在给药期大鼠出现死亡情况，死亡率为33.3%。见表1。

2.2 芒果苷和别嘌醇对大鼠体重和摄食量的影响 给药期内，溶媒对照组大鼠和芒果苷高低剂量组大鼠的体重在4周中均增长明显，但两组之间体重差异无统计学意义；别嘌醇组大鼠体重在给药期间内体重增长缓慢，与溶媒对照组和芒果苷高低剂量组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，尤其是给药第1周，别嘌醇组大鼠体重明显减轻，可能由于胃肠道不良反应所造成。见表1。给药期内，芒果苷高低剂量组大鼠的摄食量与溶媒对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；别嘌醇组大鼠给药后第1、2周摄食量有显著下降；芒果苷高低剂量组之间大鼠体重和摄食量差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 芒果苷和别嘌醇对大鼠死亡率的影响

表2 芒果苷和别嘌醇对大鼠体重的影响

表3 芒果苷和别嘌醇对大鼠摄食量的影响

2.3 芒果苷和别嘌醇对大鼠血液学的影响 与溶媒对照组和芒果苷高低剂量组相比，别嘌醇组大鼠的红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞容积(HCT)和淋巴细胞百分比[LYM (%)]明显降低，而单核细胞的百分比[MON (%)]和绝对值[MON(109/L)]显著升高；芒果苷高低剂量组之间大鼠的血液学指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 芒果苷和别嘌醇对大鼠血液学的影响

2.4 芒果苷和别嘌醇对大鼠血清生化学的影响 与溶媒对照组和芒果苷高低剂量组比较，别嘌醇组大鼠谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和高密度脂蛋白(HDLC)明显升高，而血尿酸(UA)显著降低。与芒果苷高低剂量组比较，别嘌醇组大鼠碱性磷酸酶(ALP)显著升高(P<0.05)。实验结果表明，别嘌醇可引起大鼠肝细胞损伤、肾功低下，肾小球滤过率下降。与溶媒对照组比较，芒果苷高低剂量组大鼠CREA和UA有增高的趋势，总胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)有降低的趋势，但都没有显著性差异；而芒果苷高低剂量组ALP却显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时，芒果苷高低剂量组之间大鼠的血清生化学指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 芒果苷和别嘌醇对大鼠血清指标的影响

续表5

2.5 芒果苷和别嘌醇对脏器重量和系数的影响 芒果苷高低剂量组大鼠各脏器重量和系数与溶媒对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与溶媒对照组和芒果苷高低剂量组相比，别嘌醇组大鼠的脾脏重量、肾脏重量和肾脏系数明显增加；芒果苷高低剂量组之间大鼠脏器重量和系数差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 芒果苷和别嘌醇对大鼠脏器重量的影响

2.6 芒果苷和别嘌醇对肝肾等脏器的病理学观察 肉眼可见溶媒对照组、芒果苷高低剂量组大鼠肾脏表面光滑，色泽正常，未见充血，粘连等异常改变，别嘌醇组大鼠的肾脏增大，颜色变浅，表面呈颗粒样，质硬；HE染色，显微镜下可见别嘌醇组大鼠肾小管扩张、肾间质局灶性纤维化、肾小管腔内蛋白管型和细胞管型，肾小管腔内出现有蛋白质、细胞、细胞碎片浓聚成的管型，肾间质少量炎细胞浸润。而溶媒对照组和芒果苷高低剂量组大鼠肝、肾、胃、脾、胰等组织器官未观察到与给药相关的变化。如图1所示。

图1 芒果苷和别嘌醇对肝、肾等脏器的形态学的影响(HE染色)

3 讨论

在前期研究中发现芒果苷能显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，且显示出高效、低毒的特点。为了进一步探讨芒果苷的安全性，比较研究芒果苷和别嘌醇的长期毒性，发现别嘌醇对大鼠一般状态、血液系统、消化系统、泌尿系统改变明显，而芒果苷对大鼠无上述改变，而且别嘌醇的上述改变与临床别嘌醇可引发肝、肾毒性的报道相一致[7-8]。其不良反应的机理是可能为该药有巯基化学结构,此结构可诱发某些疾病,可引起系统性器官损害,其临床表现及组织学变化与移植物抗宿主反应(GVHR)非常相似[9]。

在实验中大鼠经4周灌胃给药后，芒果苷高低剂量组大鼠外周血细胞计数和溶媒对照组大鼠差异无统计学意义(P>0.05)；而别嘌醇一方面可显著减少大鼠RBC、HGB HCT，另一方面别嘌醇组大鼠的MON绝对值升高、LYM百分比降低，均说明了别嘌醇对造血系统有影响，其机制可能与细胞或体液免疫对造血细胞抑制有关，与文献报道相一致[10-12]。

肝内转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶，是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”。当肝细胞发生炎症、坏死、中毒等，造成肝细胞受损时，转氨酶便会释放到血液里，使血清转氨酶升高。ALT和AST升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，是最常用的肝功能指标。本实验中，别嘌醇组大鼠ALT和AST与其他各组相比明显升高，均表明给予别嘌醇4周后大鼠肝脏损伤，肝功下降，与文献报道的别嘌醇致肝损害相一致[13-14]。与溶媒组大鼠相比，芒果苷高低剂量组大鼠ALT和AST差异无统计学意义(P>0.05)，表明芒果苷对大鼠没有肝损伤。

ALP是肝脏、骨组织、小肠、肾、肺等产生的同工酶，血清中的ALP主要来自肝脏和骨组织， ALP测定主要用于诊断肝胆和骨组织系统疾病。ALP主要从胆道排泄，当肝细胞受到损害或胆道排泄障碍时，血清ALP升高；当发生贫血、重症慢性肾炎、抑制成骨细胞活性时ALP会偏低[15-16]。本实验结果中，与溶媒对照组相比，别嘌醇组大鼠的ALP有增高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明别嘌醇虽然对肝细胞有损伤，但可能对ALP的排泄无影响，因此大鼠血清ALP无明显变化；与溶媒对照组比较，芒果苷组大鼠血清ALP显著降低(P<0.05)，推测可能是影响成骨细胞活性，但需要进一步研究证实。

灌胃给予芒果苷和别嘌醇4周后，芒果苷高低剂量组大鼠BUN和CREA无显著性改变；而别嘌醇组大鼠尿素氮BUN和CREA与其他各组相比明显升高，实验表明其肾功低下，肾小球滤过率下降； UA与其他各组相比明显降低，表明肾小管重吸收障碍。别嘌醇对肾损伤的机制可能与作为半抗原的别嘌醇代谢产物氧别嘌醇引起机体超敏反应导致肾间质及小管病变有关，炎细胞侵入小管壁，甚至导致区域性肾小管坏死，免疫蛋白和补体的沉积在肾间质和肾小管基底膜上，肾小管呈不同程度退行性变伴肾功不全[17-18]。

综上所述，芒果苷低剂量(300mg/kg)组和高剂量(1000mg/kg)组对大鼠的体重、摄食量、血液学指标、血清生化指标等无明显影响，且两剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)，实验结果表明芒果苷给药4周，对大鼠无明显的毒副反应。别嘌醇(360mg/kg)组可产生对血液系统、肝和肾脏的毒性,主要表现为红细胞总数减少、白细胞总数升高、中性粒细胞升高、肝肾功能损伤、肾脏肿大、出现肾小管扩张、各种管型等病理改变，以上特征类似于别嘌醇过敏综合症，其发生机理可能是T淋巴细胞介导的毒性代谢产物迟发型过敏反应，也可能与别嘌醇的代谢产物氧嘌呤醇致变态反应有关。