基于主成分分析和聚类分析的不同厂家三黄片质量分析

崔新刚 王颖莹 王新胜

1. 洛阳市妇幼保健院，河南 洛阳 471000；2. 洛阳市食品药品检验所，河南 洛阳 471000；3. 河南科技大学化工与制药学院，河南 洛阳 471000

三黄片系由大黄、黄芩浸膏、盐酸小檗碱组成的中药复方制剂，具有清热解毒、泻火通便的功效，为《中国药典》收载的成方制剂[1]。主治三焦热盛、目赤肿痛、口鼻生疮、咽喉肿痛、心烦口渴、尿黄便秘[2]。目前，我国已有数家药厂的三黄片投放市场，但临床反映不同厂家三黄片的质量存在差异[3]。目前，报道市售三黄片质量控制方法多为单味药大黄或其中两味有效成分的检测含量测定[4-6]，并不能全面反映市售三黄片的质量差异。《中国药典》2015年版中规定对三黄片中的大黄素和大黄酚总量、盐酸小檗碱以及黄芩苷含量进行测定，以此作为三黄片的质量评价指标。本研究基于HPLC法对不同厂家的10批三黄片指标成分进行分析，并结合聚类分析和主成分分析对其含量测定结果初步进行综合分析，探讨不同厂家三黄片质量差异，旨在为其质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪，包括G1315B型二极管阵列检测器、自动进样器(美国安捷伦科技有限公司)；KQ-100ES超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；赛多利斯BSA8201电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；易普易达Smart-S2型超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司)。

1.2 药品与试剂 大黄素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110756-201810)；大黄酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110796-201814)；盐酸小檗碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110713-201711)；10批样品分别为河南A厂(批号：190501-190702)、河北的B厂(批号：180901-181003)、山东的C厂(批号：190710-190912)、贵州的D厂(批号：20190201-20190402)、广西的E厂(批号：181107-181212)；甲醇、乙腈为色谱纯(天津天津市科密欧化学试剂有限公司)；磷酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 大黄素和大黄酚的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Sysmetry C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；进样量：10 μL；检测波长：254 nm。

2.1.2 对照品制备 精密称取大黄素和大黄酚对照品适量，加无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液制成每1 mL含大黄素10 μg,大黄酚25 μg的混合溶液，即得。

2.1.3 供试品制备 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细(过三号筛)，取约0.26 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入乙醇25 mL,称定重量，加热回流1 h，放冷，用乙醇补足减失的重量，摇匀、滤过，精密量取续滤液10 mL，置烧瓶中，蒸干，加30%乙醇—盐酸(10∶1)的混合溶液15 mL，置水浴中加热回流1 h，立即冷却，用三氯甲烷强力振摇提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)的混合溶液溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 样品测定 按2.1.3制备样品溶液，精密吸取样品溶液和对照品溶液各10 μL，按2.1.1色谱条件，分别测定10个样品中的大黄素、大黄酚，以外标法计算含量。色谱图如图1所示，测定结果见表1。

图1 对照品(A)和样品(B)色谱图

表1 不同厂家指标成分含量测定结果 /mg/片

2.2 盐酸小檗碱的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Sysmetry C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：乙腈-水(1∶1)(每1000 mL中加入磷酸二氢钾3.4 g和十二烷基硫酸钠1.7 g)；进样量：10 μL；检测波长：265 nm。

2.2.2 对照品制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(500∶1)的混合溶液20 mL密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 样品测定 按2.1.4样品测定方法。色谱图如图2所示，测定结果见表1。

A.标准品 B.样品图2 盐酸小檗碱高效液相色谱图

2.3 黄芩苷的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Sysmetry C18 色谱柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(55∶45)；进样量：10 μL；检测波长：280 nm。

2.3.2 对照品制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

2.3.3 供试品制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理10 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 样品测定 按2.1.4样品测定方法。色谱图如图3所示，测定结果见表1。

A. 对照品 B.供试品 图3 黄芩苷高效液相色谱图

2.4 主成分分析 主成分分析(Principal Components Analysis, PCA)是使用较广的多指标线性降维变换的多元统计分析方法，广泛应用于中药的质量评价[7-8]。本研究以5个含量测定结果为变量，运用SPSS 24.0软件，对10批三黄片进行主成分分析，计算成分特征值、贡献率及累计贡献率，前3个主成分累计贡献率为 91.821%，可以反映三黄片质量，结果见图4和表2。由图4可知将不同生产厂家的三黄片大致分为4类，编号5、6、7和8为一类，编号3和4为一类，1和2为一类，9和10为一类。

表2 主成分特征值和贡献率

图4 主成分得分图

2.5 聚类分析 聚类分析是将相似样品归类的最常用方法，不仅能将样品聚类，还能反应样品间的相近程度[9-10]。本研究以5个含量结果为变量，运用SPSS 24.0 统计软件，以平均Euclidean距离为度量标准，采用组间联接的方法对10批三黄片进行系统聚类分析，结果如图5所示。由图可知在组间距为25时，将10个厂家生产的三黄片分为4类，编号5-8分为一类，编号1和2为一类，编号3和4为一类，及编号9和10为一类。该结果与主成分分析结果一致。

图5 聚类分析图

3 讨论

三黄片为我国传统的中药复方制剂，是常用临床药。由表1可知，不同厂家三黄片都合格，符合《中国药典》要求，但其中指标成分差异显著。这可能与各厂家选取药材的产地、季节及加工炮制工艺有关，建议厂家严格控制药材的基源，做到药材可以溯源，从源头保证药材的稳定。且不同厂家在生产过程中工艺路线不同，包括黄芩煎煮时间、投入溶剂量、温度和浓缩环节的温度、浸膏含水量等都影响三黄片质量。因此，厂家从源头到生产不同环节严格把关，原药材符合要求，生产工艺规范，确保生产药品质量稳定，以保证临床疗效和安全。

本实验通过主成分分析和聚类分析将同一厂家不同批次的样品聚在一组，说明同一厂家的生产工艺稳定。山东C厂和贵州D厂的三黄片聚为一类，表明两个生产厂家在原料来源和生产工艺具有类似之处。本实验系统检测了三黄片中三味药的指标成分，获得的聚类分析和主成分分析结果可为三黄片的质量控制提供依据。