枣ZjRNase1 基因的克隆及功能分析

张 玉，程 壮，甄 曼，王玖瑞，刘孟军

（1.河北农业大学 林学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001； 3.北京林果业生态环境功能提升协同创新中心，北京 100000）

核糖核酸酶（Ribonucleases）是一类核酸水解酶，广泛存在于动植物体内。它可以降解非保护环境下的RNA 分子，其主要生理功能是控制生物体细胞内RNA 的种类与数量分布，在核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解以及RNA 的转运等过程中起作用，通常被简写为RNases。RNases 不仅与植物的抗逆、衰老、雄性不育和自交不亲和有密切关系，还与动物器官发生、宿主的防御、控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒的复制等过程有关［1-2］。Sato和Egami 于1957 年从真菌米曲霉菌中发现了该家族中的重要成员核糖核酸酶T2 基因［3］。RNases T2家族属于酸性内切酶类，在真核生物的进化过程中，此类酶绝对保守，可能有着重要的生物学功能［4］。近几年，关于植物RNases T2 家族成员的研究取得了很大进展，揭示出其在植物生长发育和抗逆反应等过程发挥重要作用［5］。

枣（Ziziphus jujuba Mill.）属鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus），由酸枣驯化而来，是重要的干果树种且可以药食两用。枣果实营养价值丰富，但枣结实率不高，百花结一果［6］。枣树抗逆性强，适应干旱、盐碱等恶劣条件，是改善生态的先锋树种。随着枣全基因组测序工作的完成［7］，枣生长发育和抗性等相关的功能基因的挖掘正深入展开，已经涉及枣MADS-box 家族［8］、TCP 家族［9］和bHLH［10］等家族基因，但未见RNase T2 家族Class I 基因的报道。本研究基于已经报道的拟南芥RNase T2 家族中Class I 的RNS1 基因［11］，克隆获得了枣同源ZjRNase1 基因，并对其进行了理化性质、基因结构、蛋白保守域结构和不同组织器官的表达量分析，在此基础上还进行了农杆菌介导的拟南芥遗传转化试验，以探究该基因的功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在河北农业大学枣中心枣资源圃，选取‘冬枣’叶片作为ZRNase1 基因的克隆材料，根、茎、叶、花和幼果作为ZjRNase1 基因不同组织表达量的分析材料。试验材料在田间采集后包裹进锡箔纸中，迅速保存在液氮里，带回室内后存于-80 ℃，用作后续RNA 提取。每个样品均采自3 棵树，然后进行混样，采样植株具有相同的生长年龄、栽培条件和管理水平。

1.2 试验方法

1.2.1 枣ZjRNase1 基因的克隆 通过NCBI 数据库Blastp 查找拟南芥RNS1 在枣中的同源序列，利用Primer5.0 软件设计所需的特异引物（F： ATGAGATACAGAAGCTCAATCTTGA / R： CTAAAATTTAGCAAATTGAACTTGA）进行目的基因扩增。以‘冬枣’叶片反转录所得的cDNA 为模板，进行PCR 扩增。PCR 反应体系为：引物F/R 各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 为12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL。反应条件为94 ℃ 10 min， 94 ℃ 40 s，56.6 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35 个循环，72 ℃ 10 min。回收扩增获得的目的片段产物，并克隆测序。

1.2.2 生物信息学分析 利用NCBI 数据库进 行Blastp 比对分析氨基酸序列的相似性，查找同源蛋白序列；通过CD Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行序列的结 构域分析；利用NCBI 开放阅读框在线预测软件 ORF Finder（http：//www.ncb i.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）对获得的基因序列进行预测；利用DNAMAN 进行序列比对和拼接；利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）进行基因结构分析；利用ExPASy（https：//www.expasy.org/）计 算 蛋 白 质 相对分子量和理论等电点；通过SOPMA 在线软件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二级结构；利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白的跨膜结构预测进行预测；利用SignaIP-5.0 Serve（rhttp：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测该基因的信号肽；利用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在线网站进行细胞定位预测；用MEME（http：//meme-suite.org/）进行氨基酸序列保守结构域分析。1.2.3 基因的表达分析 取用‘冬枣’不同组织器官cDNA 进行Real-time PCR 扩增。采用天根公司多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒 DP441 提取枣材料总RNA，使用全式金公司Trans Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix AT301 反转录试剂盒获取cDNA。设计枣ZjRNase1 实时定量基 因 引 物（2F：GCTGTCCAAGTAGCAACGGA / 2R：CCCTGTTGCAGTCAATCCCT）， 进行 表 达 量 的 分 析， 枣Actin 内 参 基 因 为（F：5′-GCGAGCTTCCCTGTAGGTA-3′，R：5′-CG- AACCCAGCCTTCACCATAC-3′［12］）。PCR 反应 程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s， 59.2 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共40 个循环，于72 ℃，55 s 处收集荧光信号。基因相对表达计算采用2-ΔΔCT方法。

1.2.4 过表达载体的构建PCR 获得基因片段 根据NCBI 登录的基因序列，并含有SmaΙ 酶切位点，设计引物如下（3F：CTCTAGGATCCCCATGAGAT ACAGAAGCTCAATCTTGA / 3R：AGGGACTG AC CACCCCTAAAATTTAGCAAATTGAACTTGA） 所示，以已有全长菌液为模板进行PCR 扩增。PCR反应程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性40 s， 58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物克隆pMD19-T 载体并转化大肠杆菌感受态细胞测序。

载体的构建及鉴定：将上述重组质粒及过表达载体pBI121 用SmaΙ 酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳回收DNA 片段。平末端连接酶50 ℃连接30 min后，转化大肠杆菌DH5α，利用Kan 筛选阳性克隆，测序鉴定为相应片段，提取质粒。

农杆菌菌株的制备及鉴定：参考梁芳等人［13］的具体制备及鉴定方法。

1.2.5 拟南芥的遗传转化及转基因鉴定 利用农杆菌介导法进行遗传转化试验，将构建好的过表达载体采用浸染花序的方式转化拟南芥，转化方法参考李业等人［14］。将侵染后收获的T0代转基因植株和野生型种子使用相同的方法种植和移栽。T0代拟南芥种子播于含有潮霉素抗性的1/2MS 培养基上，春化2 d 后放置培养室培养。非转入目的基因的拟南芥不具有抗性而被抗生素杀死，正常生长的拟南芥初步预测为转基因植株，待其长到4 片子叶时移栽，正常放置培养室内生长，观察生长状态。

2 结果和分析

2.1 枣ZjRNase1 基因的克隆及结构分析

将拟南芥RNS1 氨基酸序列在枣数据库中进行Blastp 比对，搜索得到了一个同源蛋白，序列同源性为63.35%， 将其命名为ZjRNase1（LOC107429010）。以冬枣叶片RNA 反转录的cDNA 为模板，经特异引物PCR 扩增所得产物，与预期基因片段大小吻合（图1）。将该片段进行切胶回收并克隆测序后，将测序结果通过 DNAMAN 进行序列比对，得到681 bp 的完整ORF 区序列。利用在线网站GSDS 分析（图2）发现该基因含有2个内含子和3 个外显子。

图 1 ZjRNase1 基因的克隆Fig. 1 Cloning of ZjRNase1 gene

图 2 枣ZjRnase1 基因结构图Fig. 2 Gene structure of ZjRnase1 gene in Chinese jujube

2.2 枣ZjRNase1 基因的理化性质分析及亚细胞 定位

枣ZjRNase1 基因编码226 个氨基酸，蛋白分子量为25.78 kD，理论分子式C2090H3501N681O882S132，该蛋白GRAVY（即总平均亲水性）值为0.707，表明其为疏水性蛋白。该蛋白不稳定系数为42.66，其值大于40，说明该蛋白是一个不稳定蛋白。该基因编码的氨基酸中由75 个α-螺旋结构（33.19%）、30 个扩展链（13.27%）、113 个无规则卷曲氨基酸残基（50.00%）、8 个β-转角（3.54%）组成，它们交替散布于整个蛋白质中。RNase1 蛋白在第1 ～6 氨基酸处位于膜内，在7 ～26 氨基酸处存在跨膜现象，第27 ～226 氨基酸处则位于膜外；经SignalP-5.0 Server 在线网站分析（图3）。该蛋白含有信号肽，属于分泌蛋白。经Plant-mPLoc 在线网站分析，基因定位在细胞质基质。

图 3 ZjRNase1 蛋白的跨膜结构及信号肽预测Fig. 3 Prediction of transmembrane structure and signal peptides

2.3 枣ZjRNase1 蛋白的保守结构域分析

从基因结构来看，基因ZjRnase1 内含子没有超过4 个，不属于Class II 类基因，故将该基因的蛋白与Class III 基因（即S-RNase）蛋白及Class I 蛋白进行结构域分析。与其他十个物种的S 蛋白进行保守域比较，发现该蛋白与其他物种Class III 基因蛋白仅具有部分大体一致的保守结构（图4），但与属于Class I 的拟南芥中的RNS1、RNS3、番茄中的RNaseLE、RNaseLX 以及水稻OsRNS4蛋白［17］保守域结构具有高度相似性，因此，获得的枣Rnase1基因应属于RNase T2家族中Class I 基因。

图 4 枣ZjRnase1 与其他物种同源蛋白的保守域分析Fig.4 Analysis of the conserved domain of ZjRnase1 among Chinese jujube and other species

2.4 枣ZjRNase1 基因的组织特异性分析

经组织器官特异性表达分析发现，枣ZjRNase1基因在茎、叶、花中表达量远远高于果实和根，具有明显的特异性表达（图5），符合RNase T2 家族中Class I 基因编码蛋白具有很强组织特异性的特征［17］。

图 5 枣不同组织器官中ZjRNase1 基因的表达Fig. 5 Expression of ZjRNase1 gene in different organs of Chinese jujube

2.5 枣ZjRNase1 基因的遗传转化分析

2.5.1 重组载体的构建 重组质粒连接、转化之后，在相应抗性培养基上培养，长出单菌落并对其进行特异性扩增，保菌送测序，并留菌保存用于后续将载体转入农杆菌中，进行拟南芥的侵染。使用引物3F/3R 对构建的过表达载体及转入农杆菌后扩繁好的载体进行特异性扩增，电泳检测结果如图6 所示，与目的基因大小一致。

图6 目的片段的PCR 检测Fig. 6 PCR detection of target fragments

2.5.2 转基因拟南芥植株表型特征 经潮霉素抗性筛选，从T0代拟南芥种子获得了T1代抗性植株，可在含潮霉素的培养基上生根生长。移栽后继续观察发现，与野生型（WT）相比T1代抗性植株（MT）叶片发生明显扭曲现象。因此，外源ZjRnase1 基因转入导致拟南芥叶片发育异常，说明ZjRnase1 基因可能参与了叶片发育过程（图7）。

图 7 枣ZjRnase1 基因转化拟南芥Fig. 7 Transformation of Arabidopsis with Chinese jujube ZjRNase1 gene

3 讨论与结论

植物RNase T2 家族分为S-RNases 和S-like RNases 两类［1,15］，也可以依据系统进化树分析分为三大类。 第一类和第二类为S-like RNases 基因，S-RNases 则为第三类，不同类别含有的内含子的拷贝数量和位置存在差异［16］。第一类含有来自许多高等植物的非S-RNase 基因，其中一些酶由于保守活性区域发生突变而失去核酸酶活性。这类酶具有多重复制子，其基因组中一般不超过4 个内含子，且具有很强的组织特异性，可能会因为环境胁迫而被诱导。第二类基因普遍存在于大多数植物中，内含子多于4 个，典型的Class II 成员有7 个或8 个内含子。其酶在N 末端有独特的一个保守的二硫化物结构，多在植物中组成性表达，具有明显的保守遗传特征。第三类基因内含子数目一般为1 ～2 个。该类基因存在于存在于玄参科、茄科、蔷薇科等植物的花中，可以降解转运花粉管中的RNA（tRNA），在植物配子体不亲和性中起作用［17］。本研究中获得的ZjRnase1 基因具有2 个内含子，其表达具有器官组织特异性，其蛋白与拟南芥等物种中属于RNase T2 家族Class I 基因编码的蛋白具有高度相似的保守结构，因此，枣ZjRnase1 属于为RNase T2 家族的Class I 基因［16-17］。

拟南芥中的RNS1、RNS3，番茄中的RNaseLE和RNaseLX，以及水稻中的OsRNS4 属于RNase T2家族的Class I 基因［16-17］，这些基因参与了生长发育与抗逆反应。番茄RNaseLX 基因可以木质部分化过程［18］或磷酸盐缺失［19］的情况下表达；反义抑制RNaseLX 可以延缓叶片脱落［20］；离体叶片在黑暗胁迫［21］下可以诱导番茄中的RNaseLE 和RNaseLX基因表达；损伤后RNaseLE 转录物优先在茎段的韧皮部和形成层细胞中积累，在伤口愈合中发挥作 用［18］。此外，Theierl K 等人研究提出了拟南芥中的RNS1 基因会在机械伤口下被快速诱导表达［11,22］。水稻中的OsRNS4 基因会在虫害或伤口损坏及病原菌侵染植株时被诱导，而且过表达OsRNS4 基因会增加植株的耐盐性，且正调控ABA 反应［23］。因此，该类基因在叶片发育和寄主的防卫反应过程起到了重要作用，但是具体反应机制以及RNase 活性是否为非生物胁迫抵抗不良环境所必须的，还有待考 证［24］。本研究将枣ZjRNase1 基因转入拟南芥，发现转基因植株叶片发生明显卷曲现象。因此，初步明确了该基因参与叶片发育过程，但具体作用机制仍需进一步研究。