长链非编码RNA H19基因多态性与胃癌遗传易感性关系的研究

应伟，王兴远，江波，周伟

广安市人民医院（四川大学华西广安医院）肿瘤科，四川 广安 638000

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率及病死率均较高，发病率居恶性肿瘤第五位，病死率居恶性肿瘤第三位[1]。迄今为止，胃癌在中国、日本仍很普遍，但目前对胃癌发病机制的了解仍甚少[2]。证据显示遗传和环境因素与胃癌的发生密切相关，胃癌的发展是多种因素共同作用的结果，包含了多种表观遗传的改变[3-4]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）长度约在200个核苷酸以上，被定义为在基因组中普遍转录的非蛋白质编码转录物[5]。其转录产物可以通过与染色质的修饰复合物结合，顺式和反式特异性沉默基因组位点，并参与细胞生长、凋亡、侵袭和转移[5-6]。H19是染色体11p15.5上的一个母系表达的印迹基因，编码一个带帽和剪接的RNA，并与癌症有关[7]。它是人类基因组中发现的第一个lncRNA，在哺乳动物的发育中起着至关重要的作用[8-11]。lncRNA的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）可影响基因表达和功能，并与人类多种疾病的易感性相关。因此，本研究拟通过对H19rs217727基因位点的SNP进行分析，研究其与胃癌之间的关联作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年3月至2018年3月广安市人民医院收治的胃癌患者的病历资料。纳入标准：经病理检查确诊为胃癌。排除标准：有血液性或其他自身免疫性疾病和肿瘤病史；既往接受过放化疗。根据纳入、排除标准，共纳入128例胃癌患者，设为病例组，均抽取静脉血约5 ml。另选取广安市人民医院同期健康体检者130例为对照组。两组研究对象性别、年龄等临床特征比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。

表1 对照组与病例组研究对象的临床特征

1.2 主要试剂与仪器

lncRNA H19引物、2×Taq聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix均购自Qiagen生物科技有限公司，标准酶试剂盒购自英国RNADOX公司，Gold ViewⅠ型核酸染色剂购自上海拜力生物科技有限公司，RsrⅡ限制性核酸内切酶购自NEB公司，核酸提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。ChemiDoc XRC凝胶电泳成像系统购自美国Bio-Rad公司，DYY-6C型电泳仪购自北京六一公司，2-16K台式冷冻离心机购自德国Sigma公司，PTC200多通道PCR扩增仪购自美国MJ公司。

1.3 标本采集

采用真空抗凝管采集空腹静脉血5 ml，3000 r/min离心10 min，放于-80℃冷冻贮存、待检。

1.4 DNA 提取及基因分型

采用酚-氯仿抽提法提取DNA，通过Nanodrop检测浓度后进行SNP分型，用PCR-RFLP技术检测研究对象中lncRNA H19的基因多态性，rs217727 C＞T基因引物：正义，5'-ACTCAGGAATCGGCTCTGGAAGGTG-3'；反 义 ，5'-GATGTGGTGGCTGGTGGTCAACGGT-3'。PCR 反应体系 15 μl，含模板 DNA 1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，2×Taq PCR Master Mix 7 μl，去离子水 5 μl。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，63 ℃ 45 s，72℃45 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物分别用RsrⅡ酶、37℃恒温水浴箱进行酶切，2%琼脂糖凝胶100 V电泳40 min，溴化乙啶染色分析酶切结果。基因型的判读由2名研究人员进行，若出现判读不一致，则需重新检测。基因分型成功率达到100%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，单因素及多因素分析采用Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 凝胶电泳实验

lncRNA H19 rs217727 C＞T被酶切为CC、CT、TT基因型，CC基因型显示为226 bp+21 bp，CT基因型为247 bp+226 bp+21 bp两条带，TT基因型为247 bp+21 bp；3种基因型中21 bp条带均不显示。（图1）

图1 rs 217727多态位点酶切图片

2.2 基因分型与测序

对照组中CC、CT、TT基因型分别为58例（44.6%）、58例（44.6%）、14例（10.8%），病例组中分别为 39例（30.5%）、63例（49.2%）、26例（20.3%）。随机抽取10%的样本进行DNA测序，其结果与PCR-RFLP分型结果一致（图2～图4）。Hardy-Weinberg遗传平衡检验提示P＞0.05，对照组的基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡。

图2 lncRNAH19rs 217727CC基因型

图3 lncRNAH19rs 217727CT基因型

图4 lncRNAH19rs 217727TT基因型

2.3 lncRNAH19rs 217727C＞T 与胃癌发生风险的关系

lncRNA H19 rs217727 C＞T在对照组与病例组中进行不同基因模型下的Logistic回归分析结果显示，共显性基因模型，TT基因型与CC基因型比较，TT基因型增加胃癌的发病风险，OR=2.76，95% CI=1.28～5.94，P=0.009，校正混杂因素后OR=2.99，95% CI=1.37～6.56，P=0.006；显性基因模型 ，rs217727 CT+TT基因型使胃癌的发病风险增加1.84倍，OR=1.84，95% CI=1.10～3.09，P=0.020，校正混杂因素后 OR=1.84，95% CI=1.10～3.09，P=0.020；隐性基因模型，TT基因型胃癌发病风险是CC+CT基因型的 2.11倍，OR=2.11，95% CI=1.05～4.26，P=0.037，校正混杂因素后 OR=2.34，95% CI=1.13～4.83，P=0.022。此外，等位基因模型中，T等位基因显著增加胃癌的发病风险，OR=1.65，95% CI=1.16～2.36，P=0.006。（表2）

表2 lncRNA H19 rs217727与胃癌发生风险的关系

2.4 lncRNA H19rs 217727基因多态性与胃癌临床特征的关系

在病例组中，按照胃癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移、远处转移进行分组，采用Logistic回归分析显性基因模型、隐性基因模型与胃癌临床特征的关系。结果显示，lncRNA H19 rs217727与胃癌分化程度、临床分期、淋巴结转移、远处转移均无关（P＞0.05）。（表3）

表3 lncRNA H19 rs217727基因多态性与胃癌临床特征的关系

3 讨论

H19基因长约2.3 kb，位于11p15.5，包含5个外显子，3个内含子[12]。研究表明，lncRNA H19在肿瘤的发生、迁移、侵袭和转移中发挥重要的作用[13]。其作为一个lncRNA，缺乏开放阅读框翻译蛋白质，然而，其最终产物为RNA序列，并参与RNA的调节[14]。由于H19基因突变与癌症发生风险及预后的关系目前仍未明确，其基因多态性一直是近年来的研究热点[15]。迄今为止，已有许多研究显示H19单核苷酸多态性与肿瘤发生风险、预后密切相关，如胰腺癌、乳腺癌、肝癌等[16-18]。然而，lncRNA H19 rs217727 C＞T基因多态性与胃癌的研究仍少有报道。

本研究通过对照研究旨在表明lncRNA H19 rs217727 C＞T基因多态位点与广安地区人群胃癌遗传易感性的关系，采用PCR-RFLP技术检测其基因型，统计分析发现TT基因型能使人群罹患胃癌的风险增大，校正混杂因素后OR=2.99，95% CI=1.37～6.56，P=0.006；通过合并杂合子与突变型纯合子，组成显性基因模型，等位基因模型中，T等位基因与C等位基因相比可显著增加胃癌的发病风险，OR=1.65，95% CI=1.16～2.36，P=0.006。TT基因型、T等位基因增加人群罹患胃癌的风险，与Yang等[16]的研究结果一致。

SNP是最简单的DNA基因突变形式，它可以发生在群体内的个体之间，并且可能影响启动子活性（基因表达）、mRNA构象（稳定性）和翻译效率[19]。虽然lncRNA H19 rs217727 C＞T基因多态性不影响H19 mRNA的表达水平，但突变可能改变翻译效率，可能导致H19结构的改变，最终影响H19的功能。研究表明，H19对胃癌的作用是通过直接上调ISM1介导的，ISM1是H19的结合蛋白，H19结构的改变可能影响H19与ISM1的结合[20]。然而，目前关于H19在肿瘤发生、发展中的具体机制仍尚不清楚。

本研究仍有局限性。首先，小样本量可能无法检测全面，人群基因受地域、环境、生活习惯等的影响可能表型不同，本研究样本来源单一。其次，纳入研究的对象无法避免选择偏倚。然而，由于缺少临床信息，如幽门螺杆菌感染的数据，使得没有对此因素进行分析。此外，由于吸烟、饮酒、个人生活习惯等数据是通过问卷收集的，仍可能存在偏倚。最后，本研究是基于广安地区汉族人群SNP与胃癌的关系研究，在数据应用上也谨慎民族、地域的差异。总之，本研究结果表明H19 SNP（rs217727 C＞T）与广安地区汉族人群胃癌风险增加显著相关，未来仍需要多中心联合、大样本、分层研究更进一步进行验证。