高效液相色谱法用于小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测与去除的研究*

关嘉成，苗 力，卢 杰，徐雅晴，于纯纯 ，徐胜伟

(1 淮南师范学院化学与材料工程学院，安徽 淮南 232038； 2 国家煤化工产品质量监督检验中心，安徽 淮南 232001)

小麦是我国重要的粮食作物，其总产量和消费量位居世界首位[1]。我国小麦产量约占世界小麦总产量的20%，以小麦为主食的人口占全国40%，因此小麦及其制品的质量安全事关广大人民群众的食品安全[2]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)主要由禾谷镰刀菌及黄色镰刀菌产生，是一种真菌毒素，俗称呕吐毒素，在小麦、大麦、玉米及其制品中较为常见，而小麦被DON污染的程度居于首位[3-4]。误食被DON毒素污染的小麦制品会出现厌食、恶心、手足发麻、呼吸急促等急性症状，长期食用，DON会在人体蓄积，产生损害肝脏、心脏、肾脏等器官的慢性毒性，严重危害人体健康[5]。开展市售小麦及其制品中DON检验事关生产厂家声誉和广大人民群众食品安全，因此我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》(GB2761-2017)中规定DON在谷物中的最大限量值为1000 μg/kg，为市售小麦粉质量监控检测工作提供了法律依据[6]。

由于霉菌无处不在，目前要完全消除小麦和小麦制品中的DON是不可能的。遵循优良的务农及加工规范，可减少受DON污染的机会。而对于受污染的小麦及其制品，采用物理化学方法处理可有效减少DON的含量。物理方法有物理分级，水洗法，物理吸附等，化学方法有臭氧降解，加入添加剂等。张来林等[7]通过采用新型比重式精选机对赤霉病小麦进行清理，实验结果表明与未清原粮相比，初清后原粮和精选后原粮DON含量分别降低73.9%和154.8%，小麦中DON含量显著下降。袁向星等[8]发现将DON含量较高的面粉经水洗分离制成淀粉和谷朊粉后，可将DON超标的面粉降至国家标准以下。李荣佳等[9]采用一种新型复合吸附剂HG对DON进行吸附，实验发现其平均吸附率为28.08%。王莉等[10]采用臭氧降解小麦中的DON，实验发现小麦中水分含量越高其去除效果越好。常敬华[11]通过在和面中加入1%的Na2CO3制成的干挂面，再煮制面条，可以加速DON毒素的降解，很好地减轻其毒性。因此DON污染的小麦通过物理化学方法脱毒对提高小麦及其制品的质量安全具有重要意义。

食品中DON的检测方法有同位素稀释液相色谱-串联质谱法、免疫亲和层析净化高效液相色谱法、薄层色谱测定法和酶联免疫吸附筛查法4种方法[12]。因免疫亲和层析净化高效液相色谱法具有高速、高效、高灵敏度、选择性好等优点[13-14]，故本文采用该法，并以《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》(GB5009.111-2016)为依据，将小麦样品在0.1 mol/L的Na2CO3溶液中浸泡48 h后，进行检测对比分析，旨在为小麦中DON的检测及去除工作提供理论依据。

1 实 验

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 仪 器

SPD-M20A岛津高效液相色谱仪，岛津国际贸易上海有限公司；电子天平(感量0.00001 g和0.01 g)，上海析平科学仪器有限公司；TG20WS高速离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；HN5-150A超声波，上海达洛科学仪器有限公司；KL-UP艾柯超纯水机，成都唐氏康宁科技发展有限公司；移液枪(10～100 μL，100～1000 μL)，北京大龙兴创实验仪器有限公司；HK-04A高速粉碎机，济南旭众机械设备有限公司；HNDK200-1氮吹仪，上海达洛科学仪器有限公司；玻璃注射器(10 mL)，姜堰区康达实验器材厂。

1.1.2 材 料

DON免疫亲和柱(载量≥1000 ng)，青岛普瑞邦生物工程有限公司；玻璃纤维滤纸(Grade 934-AH)，上海驷芮科技有限公司；水相微孔滤膜(0.45 μm)，上海兴亚净化材料厂；8种市售小麦样品。

1.1.3 试 剂

甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；聚乙二醇；氯化钠；磷酸氢二钠；磷酸二氢钾；氯化钾；盐酸；标准品：脱氧雪腐镰刀镰刀菌烯醇(C15H20O6，CAS号：51481-10-8)，纯度≥99%。

1.1.4 仪器工作条件

检测器为紫外检测器；色谱柱为C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇+水=20+80；流速为0.8 mL/min；柱温35 ℃；检测波长：218 nm，进样量：50 μL。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

本实验在已检测出DON的小麦中选取8种DON不同含量的小麦进行去除对比分析。

将8种小麦分成两组，一组用碾米机脱皮后，再用磨粉机粉碎，收集面粉待测，依次编号为A-1，B-1，C-1，D-1，E-1，F-1，G-1，H-1；一组分别浸泡在0.1 mol/L碳酸钠溶液(样品重：溶液体积=1：10)中48小时，然后用超纯水清洗，晒干后依次进行脱皮、粉碎，面粉收集待测，依次编号为A-2，B-2，C-2，D-2，E-2，F-2，G-2，H-2[15]。

1.2.2 提 取

在100 mL具塞三角形中准确加入25.0 g小麦粉、5 g聚乙二醇和100 mL水，混匀后超声20 min。将溶液用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集滤液于离心管中，离心5 min，离心机转速设为10000 r/min。

1.2.3 净 化

将免疫亲和柱恢复至室温，当原有的液体流尽免疫亲和柱后，准确移取上述滤液2.0 mL于玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节下滴速度，让样液以1滴每秒的流速通过免疫亲和柱。待液体排干后，分别用5 mL PBS缓冲盐溶液和5 mL水淋洗免疫亲和柱，液体以1～2滴每秒的速度流出，待空气进入免疫亲和柱中后，抽干小柱。

1.2.3 洗 脱

准确加入2 mL甲醇洗脱免疫亲和柱，流速约为1滴每秒，收集全部洗脱液于试管中，在50 ℃下，用氮气缓慢地将其吹至近干。加入1.0 mL初始流动相，涡旋30 s溶解残留物，用0.45 μm有机滤膜过滤，将滤液收集于进样瓶中，用于高效液相色谱分析。

1.2.4 标准溶液配制

标准储备溶液(100 μg/mL)：准确称取1 mg DON，用乙腈溶解后定容于10 mL容量瓶中。

标准工作溶液：准确移取适量标准储备溶液，用初始流动相配制成100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的标准工作溶液。

2 结果与讨论

2.1 DON标准曲线的制作

根据DON 100～5000 ng/mL浓度范围内标准工作溶液的色谱分析，得出其分析图谱，如图1所示。

图1 标准溶液色谱分析图

对浓度分别为100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的DON标准工作溶液进行分析，根据其浓度和对应出峰面积的线性关系作图，如图2所示。线性回归方程为y=77.682x-1505.7，线性相关系数R2=0.9999，表明采用高效液相色谱法对DON进行测量线性效果好。

图2 DON标准曲线

2.2 小麦样品中DON含量去除前后对比

将去除DON前后的小麦样品分别进行检测，结果如表1和表2所示。

表1 小麦中DON含量的检测结果

由表1可知，在检测的8组小麦粉样品中，有6组DON含量高于食品安全国家标准中规定的1000 μg/kg，小麦粉A-1中DON含量最高1958 μg/kg。两组小麦粉样品均在1000 μg/kg以下，符合国家标准，其中小麦粉H-1中DON含量最低为912 μg/kg。

表2 Na2CO3处理后的小麦粉中DON去除率

由表2知，0.1 mol/L的Na2CO3对小麦中的DON具有很好的去除效果，可以将DON含量超标的小麦粉降至国家标准1000 μg/kg以下。其中最高降低率高达76.2%，最低降低率67.3%，平均降低率为71.5%。随着小麦粉中DON的含量的减少，去除率逐渐增加。

3 结 论

本文采用高效液相色谱法对小麦粉中DON含量进行检测，由标准曲线知，线性回归方程为y=77.682x-1505.7，线性相关系数R2=0.9999。高效液相色谱法具有线性范围宽、高速、高效等优点，适合小麦及其制品中DON的检测。8种小麦粉中共检测出6种超标，在0.1 mol/L的Na2CO3溶液中浸泡后，6组原超标小麦粉的DON含量均降低至1000 μg/kg以下。两组未超标的小麦经处理后，DON去除率显著升高，去除率高达76.2%，8组小麦粉DON平均降低率为71.5%。本研究对小麦及其制品中DON含量的准确、快速检测及其去除具有一定的参考价值。