不同Wnt信号分子对胚胎肝干细胞分化的影响研究

彭 利，马文军，崔洁洁，龚梦嘉，何 昀△

(重庆医科大学附属儿童医院：1.医学检验科；2.儿科研究所干细胞实验室/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014)

肝功能衰竭是临床最常见的病死率极高的肝病症候群，严重威胁着人类的健康[1]。治疗肝衰竭最有效的方法是肝移植，但由于供肝来源严重缺乏，手术难度高等，导致很大一部分患者得不到移植的机会。最新研究结果显示，肝干细胞移植在急慢性肝功能衰竭的治疗中有重要作用，但也存在着肝细胞在体外不能大量扩增且传代后不能保持其原有细胞特性的问题。本课题组前期研究发现，肝干细胞具有长时间持续增生的能力，并且能在体外扩增获得足够的细胞数，但如何筛选和优化稳定的诱导体系、使肝干细胞定向分化在目前阶段亟待解决。Wnt信号通路在细胞增殖、分化、生长、迁徙及氧化应激等多方面有复杂的信号级联反应，调控肝脏发育和肝细胞分化[2-4]。迄今为止，对于肝细胞分化及其调控信号通路研究主要集中于β-catenin[5]，而对Wnt信号其他成员的研究相对较少。因此，本研究将集中探讨Wnt家族成员对小鼠胚胎肝干细胞诱导分化的影响，筛选出最优通路和诱导因素，以期建立有效的肝干细胞定向分化体系，为临床肝细胞移植治疗肝衰竭提供新思路。

1 材料与方法

1.1主要试剂及材料 DMEM培养基、荧光素酶检测试剂盒(NEB公司)、胎牛血清(Gibco公司)、清蛋白(ALB)抗体 (Santa Cruz)，实时荧光定量PCR试剂(Real-time PCR-SYBR®Green Ⅱ,宝生物工程公司)，糖原(PAS)染色试剂盒(SIGMA公司)，吲哚菁绿(ICG)试剂(SIGMA公司)。

1.2细胞与腺病毒感染 小鼠胚胎肝祖干细胞HP14-19由美国芝加哥大学肿瘤研究中心赠送，HEK293 细胞由本实验室保存。HP14-19 在含10%胎牛血清的DMEM培养基37 ℃、5% CO2环境下培养。19种Ad-Wnt腺病毒和表达绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)(阴性对照)由美国芝加哥大学肿瘤研究中心馈赠，扩增腺病毒，当细胞感染率达到95%时，收集细胞并离心，得病毒液，-80 ℃保存。病毒感染细胞接种于24孔板上，24 h荧光显微镜检测GFP表达。

1.3荧光素酶活性检测 在24孔板上接种携带ALB-Gluc报告基因的HP14-19细胞，分别加入Ad-GFP和Ad-Wnt病毒液，在转染后的第4、6、9天取上清液检测荧光素酶活性。每组设置复孔，重复试验3次，在酶标仪上选择470 nm波长处读数。

1.4实时荧光定量PCR检测delta蛋白(DLK)、甲胎蛋白(AFP)等肝细胞特征性标志物mRNA水平 采用SYBR Green®Ⅰ染料法检测各组细胞中 DLK、ALB、AFP、上皮特异性标志物细胞角蛋白18(CK18)等标志物 mRNA的表达量。分别收集各组细胞转染9 d后总RNA，逆转录制备cDNA，实时荧光定量PCR：SRBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，模板cDNA 2 μL，上下引物各0.5 μL (10 μmol/L)，灭菌双蒸水10 μL。PCR条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40个循环。实验重复3次。

1.5PAS染色实验 HP14-19细胞加入Ad-GFP和Ad-Wnt3a病毒液。弃原培养基， 4%多聚甲醛固定15 min；后加入高碘酸溶液，室温放置5 min；希夫试剂染色15 min；苏木染色1 min；流水冲洗2 min，1%氨水10 s，流水冲洗。显微镜观察。

1.6ICG摄取功能检测实验 HP14-19细胞分别加入Ad-GFP和Ad-Wnt3a病毒液，24孔板进行分化培养，加入配制好的ICG工作液于24孔板中(500 μL/孔)，在37 ℃中孵育1 h；显微镜下观察细胞被诱导后的ICG摄取情况及细胞形态变化，拍照记录。

1.7统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行处理。组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1免疫荧光染色结果 重组腺病毒Ad-GFP 和Ad-Wnt 1-16均能够高效转染 HP14-19 细胞，转染率为60%～80%，其中GFP、Wnt3a、Wnt5b和Wnt11转染结果见图1 。

2.2荧光素酶报告基因活性检测结果 19种Wnt腺病毒均能有效感染HP14-19细胞并表达相应的Wnt信号蛋白，随着处理时间的延长，荧光素酶值的读数逐渐升高，组间比较发现，Wnt2、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8a组较GFP阴性对照组明显增高，其中Wnt3a的作用最明显。 见图2。

图1 不同重组腺病毒对HP14-19细胞的感染情况(200×)

图2 HP14-19转染后第4、6、9天的ALB-GLuc活性

2.3mRNA表达情况比较 实时荧光定量PCR结果显示，Ad-Wnt3a组肝干细胞标志DLK、AFP表达明显下降；肝细胞特异性成熟标志ALB、CK18明显上调(图3)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 肝表面标志物DLK、AFP、ALB、CK18的mRNA表达情况

图4 Ad-Wnt3a处理后HP14-19细胞PAS染色情况(100×)

2.4PAS染色实验结果 HP14-19细胞PAS染色呈弱阳性，而Ad-Wnt3a处理后10 d，PAS染色可见70%～80%的细胞染色阳性，细胞质内存在大量紫红色颗粒，细胞形态由多角形变为长梭形(图4)。

2.5ICG摄取实验结果 HP14-19细胞几乎没有ICG摄取能力，但经Ad-Wnt3a处理后，ICG摄取实验可见大量绿色圆形或者多边形阳性细胞(图5)。

图5 Ad-Wnt3a处理后HP14-19细胞ICG摄取情况(100×)

3 讨 论

肝功能衰竭是临床最常见的肝病症候群，其病死率高，且在我国发病率呈上升趋势。肝癌干细胞/前体细胞理论的提出是人们对肝脏疾病及其治疗认识的新开始[6]。肝干细胞移植已经成功应用在动物模型及体外试验中[7-8]，但其在细胞的再生、分化中的作用机制仍没有明确。深入开展胚胎肝干细胞分化成熟机制的研究对认识肝脏发育、治疗肝衰竭及肝干细胞的临床应用有重要作用。

肝干细胞的分化是一个复杂、受多种因素影响的过程，多种因子和通路在促进分化的过程中起关键性调控作用。Wnt信号通路具有广泛的生物学功能，在多种细胞增殖、分化、生长、迁徙及氧化应激等多方面有复杂的信号级联反应，也在肝脏发育和肝细胞分化调控中具有重要作用。现阶段已发现的Wnt蛋白有19种，分别参与了细胞生长分化、胚胎形成及肿瘤发生过程[9]。本研究中，通过ALB启动子启动的荧光素酶报告基因活性检测筛选发现，Wnt2、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8a均能有效诱导肝细胞清蛋白表达，其中Wnt3a组ALB荧光素酶活性最高，提示Wnt3a可在成熟的肝细胞中高表达。HP14-19细胞自身PAS染色呈弱阳性，几乎没有ICG摄取能力，而经Ad-Wnt3a处理后，70%～80%的细胞PAS染色可见阳性，ICG摄取实验可见大量绿色圆形或者多边形阳性细胞，证实Wnt3a诱导的HP14-19细胞可表达成熟肝细胞表面标志物，由此得出结论，Wnt3a能够诱导HP14-19向成熟肝细胞分化。Wnt3a是Wnt蛋白中一种重要的亚型，其分布广泛，调节基因多样，主要通过经典Wnt信号途径发挥作用[10-11]。课题组前期研究发现，Frizzeld受体的同源分泌形式即分泌型同源卷曲蛋白家族(SFRPs)能够与Wnt蛋白特异性结合，从而竞争性抑制Wnt蛋白与Frizzeld受体结合，阻止信号传导[12]。Frzb是SFRP2的一个亚型，二者仅可在发育早期的肝组织中被检测到，而成熟阶段的肝细胞中几乎检测不到，即Frzb的表达下调，由此推测在肝细胞的分化过程中，Wnt3a高表达而其拮抗因子Frzb表达下调可能是肝脏发育和肝细胞分化所必需的。

研究发现Ad-Wnt3a 诱导HP 14-19 细胞高表达 Wnt3a后，PAS染色结果显示细胞形态由多角形转变为长梭形，同时实时荧光定量PCR结果显示，HP14-19细胞中CK18的表达量明显下调。有研究发现Wnt 信号途径在小鼠肝前体细胞发生上皮-间质转化 (EMT) 的过程中发挥重要作用[13]，但其具体的机制仍不明确。Wnt3a是Wnt经典途径的代表蛋白[14-15]，此外，Wnt3a的高表达可以显著升高EMT转录因子Snail的表达，而Snail作为EMT过程中的关键调控因子，可通过抑制间质标志物E-钙黏附蛋白的表达使N-钙黏附蛋白表达上调，从而削弱细胞间的连接，诱导EMT发生[16]。由此，研究者推断Wnt3a在诱导HP14-19向成熟肝细胞分化的同时介导了EMT的发生。

4 结 论

Wnt信号通路在肝脏发育和肝细胞分化调控中具有重要作用。本研究利用不同Wnt蛋白基因的19种重组腺病毒，分别感染HP14-19细胞，通过荧光素酶报告系统筛选、肝细胞相关标志物的表达检测，PAS实验和ICG摄取实验检测肝细胞功能，Wnt3a蛋白是诱导HP14-19细胞成熟分化的重要蛋白，诱导分化后的细胞类似于成熟肝细胞，有较强的合成代谢功能。研究结果进一步说明了Wnt蛋白在肝干细胞分化调控中的作用，对进一步研究肝干细胞分化调控及肝移植应用有重要意义。