淋巴细胞亚群在新型冠状病毒肺炎患者外周血中的表达及临床意义*

李 泉，聂 珂△，乔正荣，代 涛，吴小兰，李勇朴，柏 艳，左福林，周丽莉，朱小岚,彭孝斌

(重庆市长寿区人民医院：1.医学检验科；2.感染科；3.呼吸重症科；4.放射科，重庆 401220；5.重庆市长寿区疾病预防控制中心检验科，重庆 401220)

2019年12月，湖北省武汉市出现多起不明原因肺炎病例。目前，该肺炎被证实为一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染所致，且这种病毒存在人传人现象[1-2]。该病毒属于冠状病毒科β属，直径60～140 nm，具有多形性，外有包膜，内含圆形或椭圆形颗粒，国际病毒分类学委员会将其命名为SARS-CoV-2[3]。国家卫生健康委员会目前已将SARS-CoV-2感染所致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)纳入乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施进行管理[4]。COVID-19的主要临床表现以发热、乏力、干咳等呼吸道感染症状为主，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等，但有部分患者表现为隐匿发病，无明显症状。重症COVID-19患者在发病1周后可出现呼吸困难和(或)低氧血症，并快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出、凝血功能障碍，最终导致患者死亡[5-6]。目前实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测SARS-CoV-2核酸阳性是COVID-19诊断的金标准[4]。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》[4]将发病早期白细胞总数正常或降低、淋巴细胞计数减少定为COVID-19的临床表现之一，但目前关于COVID-19患者淋巴细胞亚群检测的相关研究较少。本研究探讨了外周血淋巴细胞亚群在COVID-19患者中的表达水平及临床意义，以期为COVID-19的早期诊断和治疗提供实验室依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月18日至2月25于重庆市长寿区人民医院住院治疗的25例SARS-CoV-2核酸检测阳性的患者为研究对象。其中21例确诊为COVID-19，有发热、咳嗽、乏力等临床症状，SARS-CoV-2核酸检测阳性的患者纳入COVID-19组；4例无临床症状，但SARS-CoV-2核酸检测为阳性的患者纳入无症状感染组。COVID-19组男10例，女11例；年龄为12～76岁，平均(51.84±6.24)岁。无症状感染组男2例，女2例；年龄为50～57岁，平均(53.00±0.51)岁。选取同期体检的20例健康者为对照组,其中男9例，女11例；年龄为15～66岁，平均(43.05±5.48)岁。COVID-19诊断标准[4-5]：符合流行病学相关特征、符合疾病相关临床表现，且咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液检测SARS-CoV-2核酸为阳性。3组研究对象年龄、性别等基本资料比较，差异无统计学意义(P<0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂 流式细胞仪(型号BriCyte E6)、CD3/CD16+56/CD45/CD19 检测试剂(流式细胞法-FITC/PE/PerCP/APC)和CD3/CD8/CD45/CD4 检测试剂(流式细胞法-FITC/PE/PerCP/APC)均由深圳迈瑞科技有限公司提供。

1.3检测方法 研究对象均采集乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2) 抗凝静脉血2 mL作为待测标本。取试管2支，1支试管中加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4 试剂，标记为“T”，另1 支试管中加入20 μL CD3/CD16+56/CD45/CD19 试剂，标记为“BNK”；然后分别向2 支试管中加入待测标本50 μL，混匀，室温避光孵育15 min；再分别向2 支试管中加入450 μL 1×溶血素，混匀，室温避光孵育5～10 min，上机检测。总淋巴细胞计数参考区间：≥1 530/μL；自然杀伤细胞计数(NK#)参考区间：≥84/μL。

1.4观察指标 分析COVID-19 组与无症状感染组患者总淋巴细胞计数(Lym#)及NK#水平；比较3组淋巴细胞亚群检测结果，包括T淋巴细胞百分比(T%)、B淋巴细胞百分比(B%)、NK细胞百分比(NK%)、CD4+T淋巴细胞百分比(CD4+T%)、CD8+T淋巴细胞百分比(CD8+T%)、Lym#、T淋巴细胞计数(T#)、B淋巴细胞计数(B#)、CD4+T淋巴细胞计数(CD4+T#)、CD8+T淋巴细胞计数(CD8+T#)、NK#、CD4+T#与CD8+T#比值(CD4+T/CD8+T)。

1.5统计学处理 采用SPSS25.0 软件进行数据分析，采用GraphPad Prism 6.0绘图。偏态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，组间比较采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1COVID-19组患者Lym#及NK#水平 21例COVID-19患者中，18例(85.71%)患者的Lym#水平低于参考区间下限，3例(14.29%)患者的Lym#水平在正常参考区间内，见图1。20例(95.24%)患者的NK#水平低于参考区间下限，且19例患者的NK#水平均低于50/μL，严重者仅为4/μL；仅1例患者的NK#水平在正常参考区间内，见图2。

注：#1～#21分别代表21例确诊为COVID-19且有临床症状患者。

注：#1～#21分别代表21例确诊为COVID-19且有临床症状患者。

2.2无症状感染组患者Lym#及NK#水平 在4例无症状感染患者中，仅有1例患者的Lym#水平为1 353/μL，略低于参考区间下限，其他患者的Lym#、NK#水平均在参考区间内。见图3～4。

2.33组淋巴细胞亚群检测结果比较 3组间T%、B%、NK%、Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#、NK#水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。COVID-19组T%、B%水平高于对照组，NK%、Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#、NK#水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。COVID-19组NK#及NK%水平低于无症状感染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注：#22～#25分别代表4例核酸检测阳性但无临床症状的患者。

注：#22～#25分别代表4例核酸检测阳性但无临床症状的患者。

表1 3组淋巴细胞亚群结果分析[ M(P25，P75)]

3 讨 论

淋巴细胞是人体的免疫细胞，在不同部位分化成熟，可分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞。淋巴细胞是在适应性免疫中起关键作用的细胞，是免疫系统的核心成分，使免疫系统具备识别和记忆抗原等能力，从而清除入侵机体的细菌、病毒等。

本文通过对21例COVID-19患者与20例健康体检者的淋巴细胞亚群进行分析发现，85.71%的COVID-19患者表现为Lym#减少，95.24%的COVID-19患者表现为NK细胞减少，且与对照组比较，Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#水平均降低(P<0.05)。SARS-CoV-2可侵袭患者的淋巴结和脾等免疫器官，不断增殖，从而感染更多的淋巴细胞和单核细胞，致其调亡，因此COVID-19患者表现为淋巴细胞减少。但有研究发现，在SARS-CoV-2感染后，短时间内机体为了对抗SARS-CoV-2感染，会产生特异性T淋巴细胞免疫反应，所以COVID-19患者感染早期可表现为T%和B%高于对照组[7]。

NK细胞具有细胞毒效应，无需抗原预先致敏就能杀伤靶细胞，其杀伤作用早于T淋巴细胞，因此在病毒感染后的早期免疫反应中发挥着重要作用。然而，为了适应NK细胞的选择压力，许多病毒已经具备了逃逸宿主NK细胞免疫反应的策略，大致包括上调NK细胞抑制信号[8]、下调NK细胞激活信号[9]、黏附分子[10]及分子模拟策略[11]。本研究发现，与对照组比较，COVID-19组患者NK%，NK#显著降低(P<0.05)。COVID-19患者NK细胞减少的原因可能与以下相关：(1)患者本身免疫功能存在缺陷，NK细胞数量较少；(2)NK细胞在对抗SARS-CoV-2时发生自身消耗，机体的造血系统未能及时进行补充；(3)SARS-CoV-2感染机体后，侵犯机体免疫系统，病变累及淋巴结、扁桃体、脾和骨髓，出现多器官功能障碍，破坏NK细胞或抑制NK细胞的生成[9-10]。以上3点单独或同时存在都可能造成人体在感染初期无法通过NK细胞来及时清除被病毒感染的细胞，最终导致COVID-19的发生。本研究4例无症状感染患者中，仅有1例患者的总淋巴细胞计数为1 353/μL，略低于正常参考值，其他患者的Lym#、NK#均在正常参考区间内。可能是由于SARS-CoV-2感染后，无症状感染者自身免疫功能强，产生大量NK细胞杀伤病毒，保护机体各器官不受损伤，所以未表现出临床症状[11]。此外，本研究观察到部分治疗恢复期的COVID-19患者临床症状与NK#有关，NK#恢复正常的患者其临床症状恢复时间短于NK#异常者,但由于病例数较少，未进行相关统计分析，后续将进一步研究验证。

4 结 论

COVID-19患者存在淋巴细胞亚群水平的异常，其中NK细胞下降明显；COVID-19患者、无症状感染者与健康者淋巴细胞亚群水平存在差异，提示淋巴细胞亚群在COVID-19的诊断、病情评估中可能具有一定的临床价值；此外，通过淋巴细胞亚群检测还能了解患者的机体免疫情况，有利于判断预后。