抗肿瘤药物体外药效学评价结合细胞生物学实验教学促进教研融合

蔡燕飞， 陈 蕴， 史劲松， 金 坚

（江南大学药学院，江苏无锡214122）

0 引 言

近年来随着细胞生物学实验技术和实验方法的不断更新与发展，细胞生物学已经渗透到免疫学、遗传学、分子生物学和药理学等生命科学的多个分支学科，并逐渐成为现代生命科学中的一门重要的基础前沿学科［1-2］。因此，对细胞生物学实验课程体系的改革和建设是提高细胞生物学实验教学质量的重要环节。

在例如细胞生物学这类基础实验教学中，传统的验证性实验教学已显现出诸多弊端，严重地影响了对学生综合实验素质的培养。传统的基础实验教学采取单一、填鸭式的教学方式，且仅传授给学生一些基本的实验技能和方法，在培养学生的综合研究能力方面很少下工夫［3-5］。钱伟长先生曾说，“大学必须拆除教学与科研之间的高墙；教学没有科研做底蕴，就是一种没有观点的教育，没有灵魂的教育”。因此通过教研结合，将科研内容引入到实验教学过程中，促进科研与教学的有机结合，这样不仅可以增加学生对科研知识的学习兴趣，同时也有利于理论知识的巩固，对培养学生的创新能力和实践能力意义重大。同时，也可以将教学过程中获得的研究结果转化到科研成果中，帮助快速推进科研项目进展，两者相互促进相互补充，一举多得［6-8］。

为此，结合科研团队的前期研究成果，设计了以“抗肿瘤药物的体外药效学评价”为主题的细胞生物学实验。以经典的广谱抗肿瘤药物阿霉素（Adrimycin，ADM）作为受试药物，通过MTT 法检测ADM对乳腺癌MCF-7 细胞、黑色素瘤B16 细胞、肺癌A549 细胞、卵巢癌A2780 细胞和肝癌Bel7402 细胞的半数致死剂量，并运用流式细胞术检测ADM 对各种细胞的促凋亡能力，从而研究ADM 的抗肿瘤效果［9-13］。通过MTT 染色法测细胞活性是细胞生物学实验中的基础实验，其实验原理和操作步骤都是常规的，但是单一的实验方法并不具备一定的创新性，如果通过教研结合，运用通用的实验方法来解决一定的科研问题，如通过MTT法对化疗药物阿霉素进行体外药效学评价，通过检测多种肿瘤细胞对ADM 的药物敏感性，从而探讨ADM的抗肿瘤效果，那么开展该综合性实验的意义就大不相同了。同时引入先进的流式细胞技术进一步验证ADM 的抗肿瘤效果的同时，也激发了学生对于科研的探索和热情，有助于学生综合实验能力的提升。

学生按照2 或3 人1 组，通过自行查阅文献，确定药物作用浓度，设计合理的实验方案，实验前期老师与学生开展一次讨论会，评估各组实验方案的科学性和可行性，并最终确定详细的实验方案。实验结束后，教师收集各组学生的统计实验结果，然后将所有数据发给每组学生，各组将全班数据进行统计分析，并最后得出结论，提交实验报告，最后以PPT 的形式分享实验结果和实验心得，并对该课程进行评价。

1 实验目的和原理

抗肿瘤药物的体外药效学研究，就是利用细胞培养技术，根据不同原理测定药物的抗肿瘤作用，例如通过肿瘤细胞活性检测、凋亡相关蛋白酶活性检测、亚细胞形态改变等途径鉴定药物的抗肿瘤效果。本实验通过经典的MTT染色法检测5 种不同来源的实体瘤细胞对ADM的敏感性，包括乳腺癌MCF-7 细胞、黑色素瘤B16 细胞、肺癌A549 细胞、胃癌A2780 细胞和肝癌Bel7402 细胞，并运用流式细胞术进一步检测ADM 对各种细胞的促凋亡能力，从而研究ADM 的抗肿瘤效果［14-15］。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT溶解液能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490 nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，MTT染色法是最经典的用于检测体外细胞活性的方法。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，通过流式细胞技术就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来［16-17］。

2 实验材料

2.1 细胞株

乳腺癌MCF-7 细胞、黑色素瘤B16 细胞、肺癌A549 细胞、卵巢癌A2780 细胞和肝癌细胞Bel7402 均来自江南大学药学院科研实验室，原始细胞均购自中科院上海细胞库。

2.2 主要试剂

胎牛血清和DMEM 培养液均购自Gibco 公司；PBS、青霉素链霉素溶液和胰蛋白酶均购自Hyclone公司；台盼蓝染色液、MTT 染色液和细胞凋亡检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。

2.3 主要仪器

二氧化碳培养箱、倒置显微镜、细胞计数仪、酶标仪、流式细胞仪等。

3 实验方法

3.1 细胞培养

5 种细胞均培养于含10% FBS 的DMEM 完全培养液中，其中MCF-7 细胞中需额外添加10 μg ／ mL的胰岛素，细胞置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内常规培养，0． 25%胰酶消化传代。

3.2 MTT染色法测细胞活性

（1）细胞按照7 000 个／孔、每孔100 μL 铺96孔板；

（2）培养过夜后，吸去上清液，按照设置的药物浓度梯度加药，每孔100 μL；

（3）药物作用72 h后，每孔加10 μL 5 mg ／ mL的MTT溶液，继续培养4 h；

（4）弃上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，摇床振荡10 min，使结晶充分溶解；

（5）用酶标仪在490 nm波长处测定其光吸收值；

（6）根据吸光值计算细胞活率，运用Prism软件，以药物浓度的lg值为横坐标，细胞活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，计算IC50 值。

3.3 Annexin V联合PI染色法检测细胞凋亡

（1）药物作用48 h后，消化细胞并计数，取1． 0 ×106个细胞离心，弃上清。

（2）用提前预冷的PBS 清洗两遍，弃上清，再加入1 mL 1 × Binding Buffer，细胞重悬。

（3）从上述悬液中取100 μL 细胞悬液加入1． 5 mL离心管，避光条件下，先加入5 μL FITC染料，再加入5 μL PI染料，常温避光孵育15 min。

（4）加入400 μL 1 × Binding Buffer 进行稀释，在1 h内将样品在流式细胞仪中进行检测。

（5）运用Flow J软件进行数据分析。

3.4 数据统计

全部实验数据经Graph Pad Prism5 进行统计学分析，结果以¯x ± s 表示，组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验，两两比较采用LSD-t检验。

4 实验结果与讨论

4.1 MTT染色法检测肿瘤细胞对ADM的敏感性

将一个自然班按照2 或3 人／组进行分组，共15组，每3 组选择一种肿瘤细胞进行实验。实验前期，学生自行调研文献，制定详细的实验方案，在经过与老师讨论后确定最终的实验方案。在MTT实验过程中，学生根据调研自行设计药物作用浓度梯度，计算好稀释方法。图1 所示为其中一组的MTT实验结果，结果表明，随着ADM药物浓度的升高，人乳腺癌MCF-7 细胞的活率逐渐下降，该组药物浓度设置较为合理，基本覆盖了完全抑制到无抑制效果的全过程，拟合的曲线呈S型，经计算ADM对人乳腺癌MCF-7 细胞的IC50 为0． 15 μmol／ L。表1 所示为将15 组实验进行统计的结果，表明ADM具有明显的广谱抗肿瘤效果，对5 种不同的肿瘤细胞均具有一定的抑制作用，其中乳腺癌MCF-7 细胞对ADM 最为敏感，其IC50 值小于1． 0 μmol／ L，肝癌Bel7402 细胞对ADM最不敏感，其IC50值大于10 μmol／ L。

图1 MTT法检测人乳腺癌MCF-7细胞对ADM的敏感性

表1 5 种不同的肿瘤细胞对ADM的药敏性检测（¯x ± s，n ＝3）

4.2 流式细胞术检测ADM的促凋亡能力

运用Annexin V 联合PI染色法检测ADM的促凋亡能力。根据MTT 实验的统计结果，选择3 μmol／ L浓度的ADM作用于各种肿瘤细胞，48 h 后检测细胞的凋亡情况。图2 所示为其中一组的流式图，结果显示3 μmol／ L 的ADM 作用于乳腺癌MCF-7 细胞48 h后，活细胞比例为0． 73%，坏死细胞比例为10． 1%，早期凋亡细胞比例为1． 72%，晚期细胞凋亡比例为87． 5%。将15 组实验进行统计，结果如表2 所示。结果显示，3 μmol／ L 的ADM 使约90%的乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡，约50%左右的黑色素瘤B16 细胞和卵巢癌A2780 细胞发生凋亡，约20%左右的肺癌A549细胞发生凋亡，肝癌Bel7402细胞几乎不发生凋亡，该实验结果与药敏性实验结果相吻合，进一步验证了ADM具有广谱的抗肿瘤药效果，但是对于不同来源的肿瘤其抗肿瘤效果有所差异，对乳腺癌MCF-7 细胞最为敏感，对肝癌Bel7402 细胞的敏感性较差。

图2 ADM对人乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡能力检测

表2 ADM对5 种不同肿瘤细胞的促凋亡能力检测（¯x ± s，n ＝3）

5 结 语

通过经典的MTT 染色法检测5 种不同来源的实体瘤细胞对ADM 的敏感性，并运用流式细胞术进一步检测ADM 对各种细胞的促凋亡能力，从而研究ADM的抗肿瘤效果。整个实验过程中，学生通过文献调研了解了抗肿瘤药物抗肿瘤活性研究的基本方法和原理，通过细胞活性和细胞凋亡检测，学生掌握了细胞培养的基本实验操作技能，熟悉了倒置显微镜、离心机等简单仪器的使用方法，了解了酶标仪、流式细胞仪等自动化仪器的检测方法，经过实验设计、实验实施、数据统计及分析一系列连贯的锻炼，学生的整体实验操作能力、分析问题和解决问题的能力、科研创新能力均有了很大提升。

从课程实施和学生反馈结果来看，仍有以下几个方面可以持续改进：①课程内容需随着科研进展进一步加深和完善。本科实验教学项目应与学科前沿的步调相一致，脱离科研的实验教学已无法达到现代人才培养的要求；②持续改进教学方式。开放式教学是目前综合实验教学的新型教学模式，但其具体的方式方法还不够成熟，还需要进一步摸索和改进；③实验设施不断完善。及时更新换代科学仪器设备，紧跟时代发展的步伐；④优化师资结构。当代细胞生物学已渗透到多个分支学科，因此对于指导教师的专业要求也随之改变，对于类似综合性的实验课程，指导教师的专业要求需更加广泛。