在线固相萃取液质联用技术的实验教学探索

杨丽萍， 虞俊超， 宋晓静， 王雁南， 崔玉晓， 姚青倩， 刘庆龙， 展思辉

（南开大学环境科学与工程学院，天津300351）

0 引 言

实验教学相对于理论教学更加直观，是培养学生知识创造能力、应用能力和创新实践能力的重要环节［1］，应该与科研工作的实际过程紧密结合，从现实问题出发，一步步建立实验方案，向学生展示获得准确、可靠科研数据的过程，以达到“授人以渔”的教学目的。随着科研和教学条件的改善，一些实验操作流程复杂、数据分析简单的仪器正在逐渐被实验操作智能化、数据分析复杂的大型精密仪器所取代。不仅开展实验教学的硬件条件得到极大改善，实验教学的内容也不再停留在单一、重复性实验上，将科研训练融入教学实践、能够激发学生参与科研活动积极性的综合型实验正在逐步成为各大高校实验教学改革的重要教学手段［2-4］。

液质联用仪广泛用于分析化学、环境检测、药物代谢等各个领域［5-7］，越来越多的高校将这种仪器用于实验教学，以拓宽学生的知识面。但由于液质联用仪对上机分析的样品要求严格，传统的样品前处理不仅操作繁琐、耗时，而且有机溶剂消耗量大，产生大量废液，不利于实验操作者的身体健康，也对环境造成了污染，因此液质联用仪实验教学很少包括样品前处理过程，这造成了教学与科研工作的脱节，不利于学生在实验教学中形成感性认识，也削弱了实验教学“学以致用”的作用。随着实验技术的发展，在线固相萃取系统以其自动化程度高、重现性好、防污染等优势，广泛应用于高校、科研机构［8-11］以及一些从事痕量分析的机构（如出入境检验检疫局）［12］。由于在线固相萃取系统省时、高效、污染小，将其用于实验教学，不仅有助于学生掌握先进实验技术，也能够完整呈现科研工作开展的流程，激发学生的学术志趣。

我校环境科学与工程学院在研究生现代仪器分析实验课程中，开设了在线固相萃取液质联用仪检测水中双酚类物质的实验。该实验以大型精密仪器为教学平台，结合环境领域研究热点，系统地向学生展示在建立难挥发的有机物检测方法过程［13］，同时，通过综合实验设计让学生了解在线固相萃取系统的工作原理，熟悉并掌握这项前处理技术，拓展学生的视野，培养学生的科研能力，为解决实际问题打好基础。

1 实验原理

双酚类化合物（Bisphenol Compounds，BPs）广泛应用在合成聚碳酸酯、环氧树脂、聚醚和聚酯等领域，是合成高分子材料的重要单体。其中，双酚A（BPA）是公认的典型环境内分泌干扰物，其生产和使用在美国和加拿大等国家受到了限制或禁止之后，双酚A（BPA）的替代品包括双酚B（BPB）、双酚C（BPC）、双酚E（BPE）、双酚F（BPF）、双酚S（BPS）、双酚Z（BPZ）、双酚AF（BPAF）和双酚AP（BPAP）的生产和使用在急剧增加。

目前，水体中双酚类物质可以通过液相色谱法、气质联用法及液质联用法进行分析，但由于这些方法采用离线固相萃取技术对水中的目标物进行富集和净化，操作复杂，耗时较多，不适用于实验教学。本实验针对环境水样，利用在线固相萃取液质联用技术，通过优化在线固相萃取条件，在15 min内完成BPA及其8种替代品的定性定量分析，实现样品准确、快速的检测。

2 实验材料和仪器

2.1 仪器

超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（Waters Xevo TQ-S，含全自动在线固相萃取（OA-SPE）系统）。

2.2 材料与试剂

标样信息：BPA（99%）、BPS（99． 7%）、BPAF（98%）购自日本TCI 公司，BPF（99． 9%）购自德国Dr． Ehrestorfer 公司，BPAP（99%）、BPB（98． 4%）、BPC（98%）、BPE（99%）和BPZ（98%）的标准品均购自美国AccuStandard公司。

试剂甲醇、乙腈均为色谱纯（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）。实验全过程使用Milli-Q 超纯水（机器型号Milli-Q Reference A +）。

3 方法与结果

3.1 在线固相萃取条件及洗脱程序

本实验在OA-SPE 系统加入了温度控制元件，考察30 ℃和45 ℃下在线固相萃取系统的效率。通过大体积的自动进样针取5 mL 水样至OA-SPE 系统进行在线固相萃取，由四元溶剂管理器（QSM）用溶剂对SPE柱进行目标物富集及干扰物清洗，过程见表1，然后通过阀的切换，由二元溶剂管理器（BSM）对目标组分进行梯度洗脱，经液相色谱质谱系统，对样品进行分析。

表1 在线固相萃取流量梯度程序

QSM 流动相A 为0． 1%（V／ V）氨水水溶液，B 为0． 1%（V／ V）甲酸水溶液，C 为甲醇，D为纯水，在线固相萃取柱型号Waters HLB Direct Connect HP 2． 1 × 30 mm，20 μm，可循环使用。

3.2 色谱条件及质谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（2． 1× 150 mm，1． 7 μm，Waters），柱温55 ℃，BSM 流动相的流速0． 3 mL／ min，其中A为0． 1%（V／ V）氨水，流动相B为甲醇，流动相梯度淋洗程序：0 ～3 min，20% B；3． 1 ～7 min，20% ～40% B；7． 1 ～10 min，40% ～80%B；10． 1 ～11． 1 min，100% B；11． 1 ～15 min，20% B。质谱条件采用电喷雾离子源的负离子模式（ESI-），多反应监测扫描模式（MRM），离子源温度和去溶剂温度分别为120 ℃和350 ℃，毛细管电压为2． 5 kV，去溶剂气（氮气）流速700 L／ h，锥孔气（氮气）流速150 L／h。9 种目标分析物质谱检测参数见本课题组前期研究成果［14］。

3.3 试样制备

用针式过滤器取水样经0． 22 μm 混合纤维素酯微孔滤膜过滤后转移至20 mL样品瓶，置于自动进样盘中待进样。

4 结果与分析

4.1 在线固相萃取温度的选择

固相萃取柱温度由30 ℃上升至45 ℃，9 种目标物的色谱峰面积没有显著差异，但出峰时间都略有提前，色谱峰变窄，峰形对称性变好，其中以BPS 最为显著。如图1 所示，固相萃取柱温度由30 ℃上升至45℃时，BPS出峰时间提前了约0． 3 min，峰宽由大于0． 5 min变为0． 1 min，峰形得到极大优化。实验结果表明，固相萃取柱温度为45 ℃时，在线固相萃取系统对9 种双酚类物质的富集及洗脱效果较好。

图1 不同富集温度下BPS的色谱图

4.2 在线淋洗条件的选择

在线萃取时，比较了从0． 1%氨水水溶液、纯水及0． 1%甲酸水溶液的淋洗条件。图2 所示对比了9 种BPs在3 种淋洗条件下的峰面积，结果表明，除BPS外，纯水淋洗的峰面积都显著低于另外两种淋洗条件。使用0． 1%甲酸水溶液的淋洗时，BPS 峰面积略低于纯水淋洗时获得的峰面积；使用0． 1%氨水水溶液淋洗时，BPS 峰面积仅为纯水淋洗获得峰面积的4%。这可能是由于BPS 的分子结构中有一个吸电子能力很强的砜基，其酸性比其他BPA 替代品更强，因此碱性淋洗条件不利于BPS 在固相萃取柱上保留造成的。综合考虑9 种BPs在3 种淋洗条件下的表现，最终采用0． 1%甲酸水溶液对固相萃取柱进行淋洗，将固相萃取柱上保留较弱的杂质淋洗下来，同时保留双酚类化合物，洗脱条件见表1。

图2 不同淋洗条件下9种BPs的峰面积

4.3 定量分析

水体中双酚类化合物的浓度大部分在0． 01 ～100 ng ／ L的范围内［15］，因此本实验采用超纯水配制不同浓度梯度（0，0． 001，0． 01，0． 05，0． 10，1． 0，5． 0，10，100 ng ／ L）的混合目标物系列溶液，并取20 mL 各个浓度的混合标准溶液转移至对应的20 mL自动进样瓶，经在线固相萃取后，进入LC-MS系统分析。以3 倍信噪比（S ／ N）对应的添加水平作为检出限（LOD），10 倍信噪比（S ／ N）对应的添加作为定量限（LOQ），9 种目标物的线性范围、LOD及LOQ见表2。

表2 目标分析物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

5 结 语

当前各高校的液质联用实验教学均偏重考证方法学，包括验证线性、精密度、稳定性和重现性的实验，而忽视了实际科研中占用大量时间的样品前处理的教学工作。造成这一现象的主要原因在于样品前处理耗时、操作复杂，实验工作量大，由于课时限制，无法与大型仪器实验课衔接。针对这一现象，本实验在前期科研课题研究的基础上，根据仪器分析实验教学任务和课时的安排，建立了在线固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定地表水中双酚A 及其8 种替代物的测定方法。该方法简便、快捷，无需手动进行复杂的前处理，且样品富集倍数高，实验结果准确。考虑到实验耗时，每组在完成色谱、质谱检测方法建立实验［13］之后，在富集温度和在线淋洗条件的实验中选择其一，每两组实验相互补充、完成全部实验内容，学生自主完成样品检测，实验所得数据两组共享，使学生同时了解富集条件、色谱条件以及质谱检测条件对实验结果的影响。本实验基于目前环境领域研究热点双酚类物质，融合了色谱、质谱等领域的知识，丰富了实验课程内容，使学生体会到先进实验技术对解决实际问题的推动作用，深刻认识科学研究的流程，有助于激发学生学习兴趣，提升学生操作技能和创新能力。