TAB3在结直肠癌中的表达及其与上皮间质化的关系研究

张 磊，黄 熠，倪宏伟

（1.大连大学附属中山医院肛肠外科，大连 116000；2.大连大学附属新华医院，大连 116000）

结直肠癌是常见消化道恶性肿瘤，我国是结直肠癌高发国，尤其是近年来其发病率和死亡率逐年增高，并呈年轻化趋势，对我国民众生命健康造成严重威胁［1］。手术是治疗结直肠癌的首选，然而术后复发和转移等难题一直未有效解决［2］。所以了解结直肠癌侵袭转移的机制，对于指导临床工作具有重要意义。研究发现上皮间质化（epithelial mesenchymal transition，EMT）与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关［3-4］。所以有关结直肠癌EMT机制的探索有助于对肿瘤的预防和治疗。EMT具体是指上皮细胞向间质细胞表型转化的过程，该过程伴随着细胞表面上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、细胞角蛋白（cytokeratin，CK）表达降低，间质标志物波形蛋白（Vimentin）、α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达增加，导致上皮细胞失去细胞极性，胞内肌动蛋白骨架重组，细胞黏附功能降低，运动能力增加［5-6］。有研究证实［7-8］，转化生长因子-β激活性激酶 1（TGF-activated kinase 1，TAK1）结合蛋白3（TGF-activated kinase 1 binding protein 3，TAB3）在乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤组织中呈高表达，并与肿瘤骨转移密切相关。然而有关TAB3在结直肠癌组织中的表达及其对结直肠癌细胞EMT的作用机制，国内外鲜有文献报道。本文以我院收治的结直肠癌患者为研究对象，检测结直肠癌组织TAB3的表达以及EMT标志物E-cadherin、CK、vimentin和α-SMA的表达，分析TAB3与EMT标志蛋白之间的相关性，探讨TAB3与结直肠癌细胞EMT的相关性。

生物医学电子学是由微电子学、生物和医学等多学科交叉的边缘科学。生物医学电子学的存在是为了使生物医学更加科学，更加精确。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2013年5月～2018年5月我院肿瘤科收治的91例结直肠癌患者为研究对象。男56例，女35例；年龄30～75岁，平均（59.4±13.2）岁；结肠癌46例，直肠癌54例。纳入标准：①经影像学和组织病理学检查确诊为结直肠癌；②之前未接受过手术治疗或放化疗。排除标准：①合并其它恶性肿瘤；②合并溃疡性结肠炎；③合并严重感染；④患者或其家属不同意参与本次研究。本研究经本院医学伦理委员会批准。

脊髓型颈椎病是常见的退行性病变。对于多种原因引起的多节段脊髓型颈椎病患者，颈椎后路单开门扩大成形术都能有效的解除压迫，缓解症状［1］。相比于传统颈椎后路单开门扩大成形术，应用微型钛板可以减少椎板成形术再关门的发生，维持椎板的开门形态，减少并发症［2,3］。目前常用的微型钛板固定方式可分为 3节段固定（C3、C5、C7）和 5节段固定（C3～C7）两种类型，比较两者的临床疗效和并发症发生情况，为临床术式选择提供参考，现报道如下。

1.2 逆转录PCR检测mRNA表达采集患者癌组织以及距离癌组织边缘5cm的癌旁组织。无菌生理盐水洗净，TRIzol RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司）抽提组织总RNA，按逆转录试剂盒（美国ABI Applied Biosystems公司操作逆转录合成cDNA，进行PCR扩增，扩增条件：94℃/5 min，（94℃/30 s、60℃/40 s、72℃/90 s，共35个循环），最后72 ℃/10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad系统分析条带灰度值，以目的RNA灰度值/β-actin灰度值表示目的RNA表达量。

恶性肿瘤的侵袭转移包括原发部位增殖，侵袭基底膜基质和正常细胞，通过循环系统进入其它器官继续增殖，形成与原发肿瘤性质相同的肿瘤形成的过程。肿瘤细胞间黏附作用减弱和细胞运动能力增强是侵袭转移发生的基础［9-10］。EMT具体是指极性上皮细胞向自由移动的间质细胞转化的现象，研究认为EMT的发生导致肿瘤细胞间黏附丧失、肿瘤基底膜和细胞外基质破坏以及细胞骨架重建，细胞运动性增强，从而更具侵袭和转移能力［5-6，11-12］。因此EMT与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。

1.3 免疫组织化学法检测蛋白表达采集患者癌组织以及距离癌组织边缘5cm的癌旁组织。无菌生理盐水冲洗干净，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片4μm。60℃烘箱烤片60min，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，柠檬酸高压抗原修复，磷酸盐洗液（PBS）淋洗，3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，PBS淋洗，滴加兔抗人一抗（抗TAB3、抗E-cadherin、抗CK、抗Vimentin、抗α-SMA），4℃孵育过夜，PBS淋洗，滴加羊抗兔二抗，室温孵育30 min，PBS淋洗，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照以PBS作为一抗代替。参照文献［7］，光学显微镜下观察染色情况，以阳性细胞比例和染色强度两方面进行综合评分。阳性细胞比例低于5%，计0分；阳性细胞比例占5%～30%，计1分；阳性细胞比例占31%～60%，计2分；阳性细胞比例大于60%，计3分。棕色染色计3分，浅棕色染色计2分，浅黄色染色计1分，无染色计0分。两项评分相乘即为最终评分，0分为阴性，1～9分为阳性。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料以mean±SD表示，组间比较采用两独立样本t检验；计量资料以率表示，采用χ2检验；采用Pearson分析TAB3与E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA mRNA之间的相关性。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性疾病，严重威胁人类健康。随着近年来生活水平的提高，人们的膳食结构、生活方式都发生了巨大变化。高能量饮食摄入过多、膳食纤维摄入过少，以及肥胖病等问题日益严重，导致结直肠癌发病率逐年升高，且呈年轻化趋势［1］。传统的手术治疗效果不尽人意，术后复发、转移率高，这也造成患者远期生存不理想的主要原因［2-3］。近年来从基因分子水平探讨结直肠癌侵袭转移的机制，逐渐成为广大学者关注的焦点。

表1 TAB3、E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA mRNA表达比较（n=91）

2.3 相关性分析结直肠癌组织中TAB3基因表达量与细胞表面上皮标志物E-cadherin和CK的表达量呈负相关，与间质标志物Vimentin和α-SMA的表达量呈正相关，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

表2 TAB3、E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA蛋白表达比较［n=91，例（%）］

图1 免疫组化学检测TAB3、E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA蛋白表达A-E分别为癌组织TAB3、E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA

2.2 TAB3、E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA蛋白表达比较癌组织TAB3蛋白阳性率大于癌旁组织，E-cadherin和CK蛋白阳性率小于癌旁组织，Vimentin和α-SMA蛋白阳性率大于癌旁组织，差异均有统计学意义（P<0.001），见表2、图1。

表3 TAB3与E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA的相关性

3 讨论

2.1 TAB3、E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA mRNA表达比较癌组织TAB3 mRNA表达量高于癌旁组织，E-cadherin和CK mRNA表达量低于癌旁组织，Vimentin和α-SMA mRNA表达量高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P<0.001）（表1）。

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然而结直肠癌发生EMT的具体机制尚不十分明确。TAB3是一个新发现的TAK1结合蛋白，研究显示其参与了免疫炎症介导、自噬等多种病理生理过程。国内邓薇等［13］学者研究发现，过表达TAB3能够增强体外培养的结直肠癌SW620细胞的侵袭和迁移能力，进一步检测发现细胞E-cadherin表达下调，而Vimentin表达上调。国外Safina等［7］以及Ding等［8］学者发现，TAB3在乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤组织中呈高表达，并与肿瘤骨转移密切相关。以上研究证实TAB3参与了肿瘤细胞EMT的发生，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。

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本研究的结果发现，结直肠癌组织TAB3 mRNA表达量较癌旁组织明显上调，而且结直肠癌组织TAB3蛋白阳性率明显高于癌旁组织。这说明TAB3确实参与了结直肠癌的发生、发展。肿瘤细胞EMT的过程伴随着E-cadherin、CK、Vimentin和α-SMA等表达改变，所以上述蛋白的表达改变可作为EMT发生的特征性表现［5-6］。本研究进一步的结果显示，结直肠癌组织E-cadherin和CK mRNA表达量低于癌旁组织，而Vimentin和α-SMA mRNA表达量高于癌旁组织；结直肠癌组织E-cadherin和CK蛋白阳性率小于癌旁组织，而Vimentin和α-SMA蛋白阳性率大于癌旁组织。这说明结直肠癌细胞存在明显的EMT现象。Pearson分析显示，结直肠癌组织TAB3表达量与E-cadherin和CK表达量呈负相关，与Vimentin和α-SMA表达量呈正相关。说明TAB3的高表达与肿瘤细胞EMT的发生相关，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。

结直肠癌组织TAB3表达明显上调，且与肿瘤细胞EMT的发生相关。然而本研究尚缺乏体外细胞试验证明，如果能够发现TAB3调控结直肠癌EMT的具体机制，则可以特异性阻断该信号通路，抑制结直肠癌EMT发生，从而抑制肿瘤细胞侵袭转移，这对于控制结直肠癌术后的复发、转移具有重大意义。