富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉中总磷脂的含量测定方法研究

文/胡淑红 王荣艳

（杭州立高检验检测技术研究院有限公司）

乳脂肪球膜（MFGM）含有丰富的磷脂。磷脂，是含有磷脂根的类脂化合物，是生命基础物质，属于复合脂，也称磷脂类、磷脂质，为两性分子，一端为亲水的含氮或磷的头，另一端为疏水（亲油）的长烃基链。磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。 另外，磷脂还具有促进脂肪代谢，防止脂肪肝，降低血清胆固醇、改善血液循环、预防心血管疾病的作用。不仅如此，磷脂还对婴幼儿神经和免疫系统的发育有积极作用，能提高婴幼儿的认知和发展，并降低很多感染的风险。因此富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉的磷脂含量测定显得十分重要。

目前尚未有对乳及乳制品中总磷脂测定的方法，其他基质中磷脂含量的测定主要有重量法、紫外分光光度法（UV法），傅立叶红外光谱法（FTIR法）等[1]。

本试验采用钼蓝法对富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉中的总磷脂（简称“试样”）含量进行测定，并对其方法的稳定性、精密度和准确度进行研究。

1 仪器和设备

分光光度计（配1 cm比色皿）、离心机（5 000 r/min）、超声波清洗器、分析天平（感量0.1 mg）、马弗炉（温度可控制在550～600 ℃）、封闭式电炉（可调温）、瓷坩埚（50 mL）、G3玻璃砂芯坩埚。

2 试剂和材料

本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的三级水。

2.1 磷酸二氢钾：使用前在（105±2） ℃下干燥2 h。

2.2 三氯甲烷-甲醇溶液（体积比2:1）：将2 倍体积的三氯甲烷和1倍体积的甲醇溶液混合。

2.3 2.5%钼酸钠稀硫酸溶液：量取1 4 0 m L浓硫酸注入3 0 0 m L水中，冷却至室温，加入12.5 g钼酸钠，溶解并加水稀释至500 mL，摇匀，静置24 h备用。

2.4 0.015%硫酸联氨溶液：将0.15 g硫酸联氨溶解并定容至1 L。

2.5 50%氢氧化钠溶液：将50 g氢氧化钠溶解在50 mL水中。

2.6 盐酸溶液（体积比1:1）：将盐酸溶解与等体积水中。

2.7 抗坏血酸钠溶液（25 g/L）：称取2.5 g抗坏血酸钠溶解并稀释至100 mL，该溶液需现配现用。

2.8 磷酸盐标准储备液：称取干燥的磷酸二氢钾0.2197 g，用水溶解并稀释定容至1 L，此溶液含磷0.05 mg/mL。

3 试验方法

3.1 样品提取

称取试样1.5 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，加30 mL三氯甲烷-甲醇溶液，涡旋混合均匀，超声30 min，于5 000 r/min转速下离心5 min，经G3砂芯坩埚过滤，用10 mL三氯甲烷-甲醇溶液分两次冲洗砂芯坩埚，滤液合并于坩埚中，将坩埚置于60～80 ℃水浴中蒸干，得到的提取物用于后续的分析测定。

3.2 试液制备

在3.1中得到的提取物中加入氧化锌0.5 g，先在电炉上加热至近干，逐渐加热至全部炭化，将坩埚置于550～600 ℃马弗炉中灼烧至完全灰化，约2 h。取出坩埚冷却至室温，加入10 mL盐酸溶液溶解灰分并加热至微沸，5 min后停止加热，待溶解液温度降至室温，将溶解液过滤至100 mL容量瓶中，每次用大约5 mL热水冲洗坩埚和过滤器3～4次，将滤液冷却至室温后，用氢氧化钾溶液中和至出现浑浊，缓慢滴加盐酸溶液至氧化锌沉淀全部溶解，再滴加2 滴盐酸溶液，最后用水稀释定容至刻度，混匀待测。

3.3 空白试验

除不加样品提取物外其余都按3.1和3.2操作。

3.4 绘制标准曲线

取6 支50 mL比色管，按顺序加入标准使用液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，再依次加入10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL水，再在6 支比色管中加入硫酸联氨溶液8 mL，钼酸钠溶液2 mL，抗坏血酸钠溶液2 mL，加塞，振摇3～4 次，去塞，沸水浴中加热10 min，取出冷却至室温，用水稀释至刻度，充分摇匀，静置10 min，移取溶液至洁净干燥比色皿中，在650 nm处以试剂空白调节零点分别测定吸光值，以吸光值为纵坐标，含磷量（0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg、0.25 mg）为横坐标绘制标准曲线。

3.5 比色

移取待测液4 mL于50 mL比色管中，加水6 mL，加入硫酸联氨溶液8 mL，钼酸钠溶液2 mL，抗坏血酸钠溶液2 mL，加塞，振摇3～4 次，去塞，沸水浴中加热10 min，取出冷却至室温，用水稀释至刻度，充分摇匀，静置10 min，移取溶液至洁净干燥比色皿中，在650 nm处以试样空白调节零点测定吸光值。

3.6 计算

试样溶液中各组分含量由标准曲线计算获得，试样中总磷脂的含量计算公式如下：

式中：

X——样品中总磷脂含量，单位为mg/g；

c——标准曲线查得的被测物的含磷量，单位为mg；

m——试样的质量，单位为g；

V1——样品灰化后的定容体积，单位为mL；

V2——比色时所取的待测液体积，单位为mL；

26.31——每毫克磷相当于总磷脂的毫克数。

当被测液的吸光度大于0.8时，需适当减少吸取被测液的体积以保证吸光度在0.8以下。

4 结果与讨论

4.1 线性考察

如表1和图1所示。

4.2 方法精密度试验

4.2.1 日内精密度

对1 份试样检测试验，做6 个平行试验，测试结果如表2所示。

4.2.2 日间精密度

对1 份试样试验，每天做4 个平行试验，做3 天试验，测试结果如表3所示。

4.3 方法准确度试验

同一试样作为本底，本底含量为62.96 mg/g，分别进行3 组不同浓度的加标试验，每组做3 个平行试验，计算加标回收率，如表4所示。

表1 磷标准曲线测试数据

表2方法日内精密度测试数据

表3方法日间精密度测试数据

表4磷脂试样加标测试数据

4.4 方法稳定性试验

分别精密量取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL浓度为0.05 mg/mL磷标准溶液至50 m L比色管中，依次加入1 0.0 mL、9.0 mL、8.0 mL、7.0 mL纯水，其余步骤同3.4操作显色，分别于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h在650 nm处以试剂空白调节零点测定吸光值。如表5所示。

4.5 样品的测定

分别对3 个批次富含乳球膜蛋白乳清粉进行总磷脂的含量测定，结果如表6所示。

4.6 讨论

从图1看出，该标准曲线的截距值较小，R2=0.999，标曲的线性良好，而且是随着磷标准液的浓度增大，钼蓝吸光度值也增大。由此可得该试验方法的钼蓝吸光度值和标准液浓度成正比。由表2，表3可得，RSD值均在3%以下，本试验方法的日内精密度和日间精密度均为良好。由表4可得，通过不同的加标量所得的回收率均在8 0%～1 0 5%的范围内，回收率的平均值均在90%以上，而且R S D值均在3%以下，试验值均比较稳定。由表5得，该方法钼蓝显色在4h内稳定。由表2，表3的精密度，表4的准确度和表5的稳定性可得，总磷脂提取较为完全，而且稳定，试验误差小，准确率高。由表6可得，不同批次的富含乳球膜蛋白乳清粉的总磷脂测定含量RSD均在3%以下，故试验测定值比较稳定。

表5 稳定性测试数据

表6 富含乳球膜蛋白乳清粉中总磷脂的含量

图1 磷标准曲线图

试验结果表明，本研究建立的方法所需设备简单，方法稳定、准确，为以富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉为原料的乳制品中总磷脂的测定提供依据。