乳制品抗生素快检试纸条的研究进展

文/董 菡 张倩瑶 成玉梁 于 航 谢云飞 姚卫蓉 郭亚辉＊ 钱 和

（1江南大学食品学院；2浙江省杭州市桐庐县检验检测中心）

乳中几乎含有人体所需要的全部营养素和大量具有保健功能的生物活性物质，营养物质非常丰富。随着乳和乳制品种类的日益增多，其在国民饮食中的地位不断提高，目前中国已成为全球最大的乳制品新兴市场[1]。但乳和乳制品的质量问题也随之成为公众焦点。其中，抗生素作为乳牛防病、治病的通用药剂被广泛用于动物药品和饲料添加剂中。抗生素对人体健康存在潜在的威胁，抗生素的不规范应用一方面会导致乳制品发酵异常，使产品理化性质发生改变，影响后期风味形成[2]；另一方面，会增加致病菌耐药性，提高食用者的疾病治疗成本，且过量抗生素会破坏人体正常菌群间的相互制约机制，扰乱机体内环境平衡[3]。

畜牧业乳产中常用的抗生素主要有青霉素类、四环素类、β -内酰胺类、链霉素类等。近年来，我国乳制品抗生素残留现象时有发生。2013年对江苏省苏州市生乳和零售牛乳制品中β -内酰胺酶进行检测，其中牛乳制品中检出率为3.2%，生乳中检出率为41.7%[4]；2013年对镇江地区市售纯牛奶和奶源户生鲜牛奶中抗生素残留情况进行调查，结果显示抗生素残留阳性率为5.86%，其中市售包装纯牛奶阳性率4.67%，袋装纯牛奶阳性率4.41%，盒装纯牛奶阳性率4.79%[5]。其他城市的相关检测结果也不容乐观，由此可见乳制品抗生素残留现象仍然存在，值得引起高度重视。

根据《GB/T 4789.27—2008食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验》，我国鲜乳中抗生素残留检测使用的方法主要是嗜热链球菌抑制法（TTC法）和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法（戴尔沃检测法），两者皆为微生物测定法。此外，还有理化检测法，如高效液相色谱检测法（HPLC）、气相色谱法（GC）等[6]。此类方法普遍建立在仪器分析的基础上，因其鉴定灵敏度和准确度较高，被广泛应用于乳制品的抗生素残留检测试验，但同时也存在检测程序较复杂、费用较高、人力物力消耗大等缺陷。而试纸法具有操作简单、体积轻小、反应快速、显示直观等特点，比较适合小型实验室或者现场操作。

试纸法是通过经特殊制备的试纸与待测成分进行反应所显示的变化来对待测成分进行目视或仪器定性的一种快速检测方法[7]。目前应用在乳品抗生素检测中的试纸条主要有胶体金免疫层析试纸条、酶联免疫试纸条、荧光免疫层析试纸条、核酸适配体试纸条和生物膜干涉试纸条。快检试纸条的突出优点是操作简单、反应迅速、携带便捷、成本低廉、显示直观，可满足监管部门对乳品进行现场初筛检测的需求，有望成为乳制品中残留抗生素检验的简易分析工具。

1 免疫分析试纸条

免疫分析技术基于免疫学原理，利用抗原抗体的免疫学动态反应过程来完成检测[8]，目前被广泛应用于制作抗生素快检试纸条。因其具有特异性强、灵敏度高、价格低廉、适用于大批量样本检测等优势，现已成为快速检测方法研究和应用的热点。根据所用标记物的不同，此技术涉及的乳制品抗生素快检试纸条主要可分为3类，即胶体金免疫层析试纸条（Colloidal gold immunochromatographic test strip，CGICAs）、荧光免疫层析试纸条（Fluorescence immunochromatographic test strip，FIAs）和酶联免疫试纸条（ELISA test strip，ELISAs）。

1.1 胶体金免疫层析试纸条

胶体金免疫层析试纸条（CGICAs）基于抗原抗体特异性结合反应以及固相标记技术，利用胶体金作为固相标记物，大孔径微孔滤膜作为载体，以夹心法或竞争法为主要方法定性检测样本中抗生素的存在[9]。目前市场上的快检试纸条多为胶体金免疫快检试纸条，其可满足同时检测多种抗生素的需求，反应快速，肉眼即可辨别现象，但相较于其他免疫层析试纸条，胶体金试纸条的灵敏度稍低。

图1 基于八重侧流免疫测定法检测各抗生素的原理图[12]

李海龙等[10]利用此类试纸条对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测，结果显示，其对其他抗生素无交叉反应，且与液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）相比，检测结果符合度可达100%。美国3M公司[11]推出的基于胶体金免疫层析技术的抗生素检测试剂条，可准确、快速、便捷地检测乳品中β-内酰胺、四环素、磺胺和喹诺酮类4 种抗生素药物的残留，试验证明其灵敏度和特异性均高于95%。

Han等[12]提出了针对牛奶中四环素、β-内酰胺、磺酰胺、氯霉素、链霉素等抗生素的免疫层析试纸条，此外还可用于黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的检测，检测时间小于20 min。这项产品创新性地提出了八重侧流免疫测定法（图1），制备特异性单克隆抗体和受体，将其结合到金纳米颗粒上，形成的8 种抗体金纳米颗粒缀合物作为检测探针；并合成8 种相应的半抗原-蛋白结合物，将其固定在硝酸纤维素膜的不同测试区域上，作为捕获抗原。此八倍体免疫反应可以同时发生在单个条带上，故可用肉眼目测进行定性分析。而对于半定量分析，可以使用智能手机的内置摄像头拍摄测试线，并用Image J软件分析强度。试验显示，所有化学物质的检出限均远低于当局设定的监管限度。此项研究开发的快速筛选牛奶中常见抗生素的免疫测定法非常有前景。

1.2 酶联免疫试纸条

酶联免疫试纸条（ELISAs）基于酶联免疫吸附技术（ELISA），将待测抗生素的抗原或抗体结合到某种固相载体表面，待检样品会与酶标抗体和固相载体表面的抗体或抗原反应，加入酶反应底物显色后，通过颜色深浅可以进行定性或定量分析（图2）。酶强大的催化效率可显著放大反应效果，使酶联免疫试纸条的检测达到很高的敏感度[13，14]。但酶标试纸不能同时检测多种成分，且对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，可与GC、HPLC等检测手段联合使用，增强其鉴定准确性。

随着基因工程和蛋白质工程的发展，酶联免疫试纸条也增加了更多技术思路。姜侃等[15]应用酶联免疫竞争层析技术设计的检测乳品中β-内酰胺类抗生素残留试纸条，在使用方便性、检测灵敏度、精密度以及交叉反应数据方面具有显著优势。Nuryono等[16]设计了采用ELISA法对印度尼西亚牛奶中黄曲霉毒M1残留的检测方法，检测限达5 ng/mL，可用于现场进行大量筛选。

1.3 荧光免疫层析试纸条

荧光免疫层析试纸条（FIAs）是一项新兴的免疫检测试纸条，结合了免疫反应和色谱层析原理，既保留了胶体金免疫层析试纸条检测快速、操作简便的优点，又增加了荧光免疫技术的高灵敏度，近年来被广泛应用于食品安全的现场筛查。量子点（QDs）是由 II～VI 族或 III～V 族元素组成的新型荧光纳米材料，是目前常用的新型荧光标记物，被聚合物材料包裹后形成量子点荧光微球（QBs），再结合待测抗生素的单克隆抗体制成荧光检测探针，由此设计的试纸条荧光强度高、稳定性强，可快速、直观地筛查残留抗生素，极具推广和应用价值[17，18]。

图2 ELISA双抗体夹心法图示

图3 CG-LFIA，LM-LFIA和TrFM-LFIA条的制备及检测原理图[20]

丁乔琪等[19]以羧基化CdTe /ZnSe量子点荧光微球为标记物，通过EDC/NHS活化法将氯霉素（CAP）单克隆抗体与量子点荧光微球偶联制备成荧光探针，组装成新型氯霉素量子点荧光微球免疫层析试纸条。该试纸条可在15 min内完成牛奶样品中CAP的定量检测，线性范围为0.1～100.0μg /L，检出限为0.1 μg /L。

如图3所示，Li等[20]建立了3 种侧向免疫层析分析（LFIA）方法，以检测牛奶中的泰乐菌素残留。该研究应用了胶体金（CG）、乳胶微球（LM）和时间分辨荧光微球（TrFM）在LFIA中用作抗体标记示踪剂，用于检测牛奶和猪肉中的泰乐菌素（TYL）和替米考星（TIM）残留。CG-LFIA，LM-LFIA和TrFM-LFIA3种方法的临界值分别为8 ng/mL、4 ng/mL和2 ng/mL，结果显示，荧光方法灵敏度显著高于胶体金方法，且可在5～8 min获得结果。通过此三类LFIAs和LC-MS / MS方法对40个牛奶样品进行了分析，结果显示，3 种方法之间具有良好的相关性，没有发现假阳性或假阴性结果。结果表明，这3 种测定方法可以提供快速、可靠的检测结果，能为现场测定大量样品中大环内酯类抗生素或其他污染物残留提供多种技术支持。

2 核酸适配体试纸条

适配体（Aptamer）是一段DNA或RNA序列，通常通过指数富集系统进化技术（SELEX）筛选获得，可与相应的靶标高亲和力、特异性结合。核酸适配体试纸条（Aptamer-based dipstick assay，ABDs）以核酸适配体作为识别因子，通过适配体与抗生素靶标结合，并利用胶体金、量子点等标记物质呈现的光学变化进行快速检测。与传统的抗原抗体免疫反应相比，适配体结合技术具有亲和力强，筛选过程简单，靶标范围广等优点。赵帅等[21]

设计的核酸适配体测流层析试纸条可高水平检测样品中的氯霉素（CAP）残留；孙春燕等[22]基于核酸适配体制作的胶体金层析试纸条，将核酸适配体与胶体金结合，利用四环素（TCY）与DNA及核酸适配体竞争结合能力的强弱，提供了一种更适于TCY现场快检的方法。

图4核酸适配体试纸条测定黄曲霉毒素（AFB1）的图示[23]

如图4所示，Shim等[23]开发了检测黄曲霉毒素（AFB1）的核酸适配体半试纸条。该试纸条采用竞争法，在生物素修饰的适配体、靶标AFB1、Cy-5标记的适配体互补序列探针的混合物溶液中插入试纸条。互补序列探针、靶标AFB1与适配体发生竞争反应，使生物素标记的适配体与靶标AFB1，生物素标记的适配体与互补序列探针在检测线处结合，因检测线处荧光强度与靶标的含量呈负相关，故可通过荧光强度确定AFB1含量，其检测限为0.1 ng/mL，以实现AFB1的半定量检测。

表1五类快检试纸条的对比分析

图5生物膜干涉技术（BLI）原理图[24]

3 生物膜干涉试纸条

由生物膜干涉技术（BLI）为原理设计的生物膜干涉试纸条（Biofilm interference test strip，BIs）是一类新型的、可定性检测乳品中抗生素残留的快检方法。其原理是当光在同质光源中传播时，如果传播距离有差别就会产生光程差（图5a），光程差导致光发生干涉现象，从而使不同波长光线的干涉形成干涉谱（图5b）[24]。当结合在生物膜传感器上的抗生素抗体或适配体与加入的样品中残留抗生素结合时，会使生物膜厚度产生变化，导致其上透过的反射光频率受到影响（图5c）[25]。若在其内添加荧光标记物，即可根据颜色变化反映现象。生物膜干涉技术具有可不借助标记物而实时检测的特点，尤适合于低亲和力或解离快速的抗体的现场快速筛查[26]。

刘小军等[27]由BLI结合纳米金信号放大技术，建立了能检测牛乳中β-内酰胺类抗生素的快检试纸条。试验结果表明，金标记的BLI较非标记BLI能够显著提高检测的灵敏性，比采用相同原料制备的免疫层析试纸条灵敏度高1倍，能快速、有效地检测出样品中抗生素的存在。陈军[28]以氯霉素半琥珀酸酯为母体，直接偶联物固着在传感器末端形成具有双层结构的生物膜，通过检测端面生物膜层的厚度变化所引起的光谱相位改变，实现样品中氯霉素（CAP）的快速检测。虽然该试验表明，采用金标记生物膜干涉试纸条检测牛乳中抗生素残留的竞争结合反应时间需要90 min以上才能达到平台期，比免疫层析试纸条方法（6 min）的检测周期要长，但该试纸条检测氯霉素残留的灵敏性要明显高于免疫层析试纸条，故该方法仍是一种简便、快捷的检测方法，可以用于牛乳中氯霉素抗生素残留的快速检测。

4 小结

随着乳制品产业的发展，乳品中的抗生素残留问题已越来越多地受到政府和消费者的重视。本文主要综述了各类快检试纸条在乳品中抗生素检测方面的研究进展（表1），着重介绍了各类抗生素快检试纸条的原理、优点及应用范围。快检试纸条具有携带便捷、操作简便、反应迅速、现象直观、经济实用等优点，在乳与乳制品残留抗生素的现场检测中具有良好前景。加大此类快检试纸条的研发与推广，能有效降低乳制品中抗生素检测的成本，大大提高乳制品中抗生素检出的准确率，严格限制抗生素的非法添加，为人们的乳饮生活提供保障。