防己药材 饮片及标准汤剂UPLC特征图谱研究
2020-09-14张文芳林碧珊梁浩明徐彤彤胡梅吴志权
张文芳,林碧珊,梁浩明,徐彤彤,胡梅,吴志权
国药集团广东环球制药有限公司,广东 佛山 528303
国家药典委员会在2016年发布《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》提出,中药配方颗粒以标准汤剂作为与临床汤剂疗效基本一致的标准参照物。深入开展标准汤剂特征图谱研究成为搭建药材-饮片-提取物-配方颗粒全产业链质量控制体系的关键环节,有助于中药配方颗粒接轨欧盟注册要求,实现中药国际化。
防己为防己科植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore 的干燥根,具有祛风止痛、利水消肿之功,主要用于风湿痹痛、水肿脚气、小便不利、湿疹疮毒[1]。本研究建立防己药材-饮片-标准汤剂的UPLC特征图谱,为防己配方颗粒质量控制标准及欧盟注册申报提供参考。
1 仪器与试药
ACQUITY UPLC 液相系统包括二元高压泵、柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器(Waters公司);CORTECS T3 C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.6 μm);MS105DU型电子分析天平(梅特勒-托利多公司);KQ-500DE型超声仪(昆山超声仪器有限公司);Synergy UV型超纯水仪(Millipore公司)。
防己诺林碱对照品(批号:110793-201606,纯度:98.8%)、粉防己碱对照品(批号:110711-201609,纯度:99.2%)均购自中国食品药品检定研究院;木兰花碱对照品(成都普菲德生物技术有限公司,批号:150813,纯度≥98%);防己对照药材(中国食品药品检定研究院,批号:121279-201502);无水乙醇为分析纯;乙腈和磷酸均为色谱纯;超纯水由MILLIPORE纯水仪制备。
15批防己药材分别于2016年8月—2018年3月收集于江西和安徽不同种植产地,详见表1,经本单位质管部黄国满主管中药师鉴定为防己科植物粉防己S.tetrandraS. Moore 的干燥根。由本实验室按照《中华人民共和国药典》2015年版一部炮制项要求制成同批号防己饮片,依据《中药配方颗粒质量控制与标准指定技术要求(征求意见稿)》制备同批号防己标准汤剂冻干粉。
表1 15批不同产地防己样品信息
2 方法与结果
2.1 色谱条件
参考相关文献方法[2-4]并对洗脱梯度、流动相组成、检测波长、色谱柱、柱温、流速等系统适应性条件进行优化,得到色谱条件如下,色谱柱:CORTECS T3 C18(100 mm×2.1 mm,1.6 μm);柱温:30 ℃;流动相:乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B),洗脱梯度(0~3 min,0%A;3~5 min,0%~15%A;5~25 min,15%~30%A;25~29 min,30%~80%A);流速:0.2 mL·min-1;检测波长:210 nm;进样量:0.2 μL。
2.2 对照品溶液制备
精密称取防己诺林碱和粉防己碱对照品适量,加甲醇制成质量浓度分别为19.9、300.6 μg·mL-1的混合对照品溶液,即得;取木兰花碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成质量浓度为141 μg·mL-1的对照品溶液,即得。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1防己药材和饮片供试品溶液的制备 前期考察药材特征图谱供试品制备方法,发现《中华人民共和国药典》含量测定项所用2%盐酸甲醇对防己诺林碱和粉防己碱的提取效果与30%乙醇一致,但对其他成分的提取效果不及30%乙醇,故选用30%乙醇作为提取媒介更能全面反映特征图谱属性。得到供试品溶液制备方法:精密称取本品粉末(过三号筛)约0.2 g,置具塞锥形瓶,精密量取30%乙醇20 mL,密塞,称定质量,超声(功率:500 W,频率:40 kHz)处理30 min,取出,放凉,用30%乙醇补足减失质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3.2防己标准汤剂供试品溶液制备 取本品适量,研细,取约0.07 g,精密称定,置20 mL量瓶中,加30%乙醇适量使溶解,超声处理(功率:500 W,频率:40 kHz)10 min,取出,放凉,用30%乙醇定容至刻度,摇匀,滤过,即得。
2.4 方法学考察
2.4.1系统适应性 取木兰花碱、粉防己碱和防己诺林碱参照物溶液进行色谱峰标定,比较保留时间和紫外吸收光谱图,确定样品色谱图中的峰归属。粉防己碱色谱峰为所有批次药材、饮片和标准汤剂所共有,其分离度良好,且为防己的药效成分和专属性成分,故以此为参照峰(S峰),规定理论塔板数按粉防己碱峰计算应不低于8000。
2.4.2精密度试验 取同批次防己供试品,按2.3项制备供试品溶液各1份,在2.1项色谱条件下,连续进样测定6次,粉防己碱峰为参照峰,各共有峰所得相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3.0%,表明仪器精密度良好。
2.4.3重复性试验 取同批次防己供试品共6份,按2.3项制备2组供试品溶液各6份,在2.1项色谱条件下进样分析,粉防己碱峰为参照峰,各共有峰所得相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明方法重复性良好。
2.4.4稳定性试验 取同批次防己供试品,按2.3项制备供试品溶液各1份,在2.1项色谱条件下于0、2、4、8、12、16、20、24 h分别进样,粉防己碱峰为参照峰,各共有峰所得相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明该方法稳定性良好。
2.5 样品测定
按2.1项下色谱条件,分别取对照品溶液、供试品溶液各0.2 μL进样测定,记录色谱图,见图1~4。
注:A.木兰花碱对照品溶液;B.混合对照品溶液;1. 木兰花碱;2.防己诺林碱;3. 粉防己碱。图1 木兰花碱对照品溶液与防己诺林碱、粉防己碱混合对照品溶液的UPLC图
图2 15批防己药材UPLC特征图谱及其对照特征图谱
图3 15批防己饮片UPLC特征图谱及其对照特征图谱
图4 15批防己标准汤剂UPLC特征图谱及其对照特征图谱
2.6 共有峰的标定
将各批防己药材、饮片及标准汤剂所得结果分别导入国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版),选择时间窗宽度为0.10 min,平均数法生成对照图谱,对色谱图进行多点校正后,自动匹配,生成图谱,经分析比对后确定11个共有峰,见图2~4。与木兰花碱、防己诺林碱和粉防己碱对照色谱图进行比对,确定7号峰为木兰花碱,10号峰为防己诺林碱,11号峰为粉防己碱。防己药材、饮片和标准汤剂对照特征图谱见图5。以峰11(粉防己碱)为参照峰,分别计算防己药材、饮片和标准汤剂各共有峰的相对保留时间和相对峰面积(RA),结果见表2。
图5 防己药材、饮片和标准汤剂UPLC对照特征图谱的比较
2.7 相关性分析
采用相似度评价系统对所有色谱图数据进行分析,以均值法生成特征图谱的共有模式,计算各批药材、饮片和标准汤剂样品的相似度,结果见表3。15批防己药材特征图谱与对照特征图谱的相似度为0.978~0.999;饮片为0.976~0.998;标准汤剂为0.962~0.999。表明药材、饮片与标准汤剂整体成分具有相似性,防己从药材-饮片-标准汤剂过程中各成分得到有效转移。
3 讨论
防己诺林碱和粉防己碱是防己药材中主要的药效成分和专属性成分[5-6]。近年来有研究报道,通过比较防己水提物及其活性单体的毒效关系,发现防己水提物的镇痛效果更优,粉防己碱作为防己的主要组分并不能够完全表征防己的药效;防己水提物停药后的肝脏毒性可逆性是粉防己碱停药后所不具备的,提示其水溶性强、极性大的生物碱类成分起了协同和持续的作用[7-8]。本研究通过防己药材-饮片-标准汤剂特征图谱分析,确定11个共有特征峰,15批防己药材、饮片和标准汤剂的相似度分别大于0.90,相似度较高,表明防己从药材经过饮片制备,到标准汤剂其成分一致,三者特征图谱具有良好的相关性;此外,研究组通过定量分析发现,15批防
表2 防己药材、饮片及标准汤剂UPLC特征图谱分析
表3 防己药材、饮片和标准汤剂的相似度计算结果
己标准汤剂出膏率为10.4%~18.3%,2个药效指标成分粉防己碱和防己诺林碱的总量从饮片到标准汤剂的转移率为18.9%~39.3%。基于定量指标,结合特征图谱可为防己配方颗粒的质量控制提供更为科学的依据。以粉防己碱色谱峰为参照峰,分别计算防己药材、饮片和标准汤剂各共有峰的相对峰面积,发现药材和饮片各共有峰的RA值基本相符,但标准汤剂RA值有提高趋势,主要原因可能是极性较大成分提取率较高,导致相对峰面积差异变大。