葛兰心宁软胶囊中绞股蓝皂苷A大鼠体内药代动力学研究

胡小虎，孙文军，高昕，王夕静

1.西安千禾药业股份有限公司，陕西 西安 710075；2.西安新通药物研究有限公司，陕西 西安 710077；3.西安交通大学 药学院，陕西 西安 710061

葛兰心宁软胶囊为西安千禾药业股份有限公司开发的由成分明确的葛根总黄酮、山楂提取物、绞股蓝总皂苷组成的中药复方制剂，具有活血化瘀、通络止痛的功效，临床用于预防和治疗瘀血闭阻所致的冠心病、心绞痛[1]。其主要组成组分绞股蓝总皂苷由绞股蓝提取制成，主要活性成分为达玛烷型皂苷类物质，含量较高，具有保护心脑血管、抗肿瘤、增强免疫等显著作用[2]，其中含量较大的皂苷为绞股蓝皂苷A(结构式见图1)。文献[3]报道了用高效液相色谱串联紫外检测器(HPLC-UV)测定绞股蓝中绞股蓝皂苷A的含量、文献[4]报道了用高效液相串联蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定绞股蓝中绞股蓝皂苷A的含量，但尚未有绞股蓝皂苷A有关药代动力学研究的文献报道。本研究应用超高效液相色谱-质谱联用分析方法(UPLC-MS)建立葛兰心宁软胶囊中绞股蓝皂苷A的体内分析方法，进行绞股蓝皂苷A的大鼠血浆药代动力学研究，为葛兰心宁软胶囊药效物质基础研究提供方法学参考和实验依据。

图1 绞股蓝皂苷A的结构式

1 材料

Waters UPLC H-Clas/Xevo TQD型超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪(QSM四元梯度泵、FTN自动进样器、6通道在线脱气机、数据处理系统MassLynx V4.1，美国Waters公司)；德国Sartorius BS124S型电子天平(0.1 mg，最大称量120 g，德国赛多利斯公司)；德国Sartorius BT125D型万分之一/十万分之一双量程电子天平[0.01 mg·(0.1 mg)-1，最大称量41 g·(120 g)-1，德国赛多利斯公司]；TD10001B型电子天平(0.1 g，最大称量1000 g，余姚市金诺天平仪器有限公司)；ULT2186-4-V -86 ℃立式超低温冰箱(美国Thermo Revco公司)；台式高速冷冻离心机(TGL16M，长沙湘智离心机仪器有限公司)；多通道微量移液器(M12-50，德国brand公司)。

葛兰心宁软胶囊(批号：20170603，西安千禾药业股份有限公司)；绞股蓝皂苷A对照品(批号：DRK-1392-920117，纯度：98.9%，成都德瑞可生物科技有限公司)；内标丹参酮ⅡA对照品(批号：MUST-16111007，纯度：99.71%，成都曼斯特生物科技有限公司)；甲酸(LC/MS级，中国国药控股有限公司)；甲醇(LC/MS级，德国Merck 公司)；乙腈(LC/MS级，德国Merck公司)；纯化水(实验室自制)。

雄性SPF级SD种大鼠，体质量220～250 g[四川省中医药科学院实验动物中心，生产许可证号：SCXK(川)2018-19]。动物接收后进行常规检疫和适应性观察，连续观察7 d，每天1次。IVC独立送风大鼠饲养系统，四川省实验动物设施使用许可证号：SYXK(川)2018-008。饲养温度：20～26 ℃，相对湿度：40%～70%，饲养密度1～5只/盒。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱方法

Waters UPLC H-Clas超高效液相色谱仪；Waters CORTECSTMUPLC C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.6 μm)；柱温45 ℃；流动相：A(0.1%甲酸水溶液)-B(0.1%甲酸甲醇溶液)，梯度洗脱(0～1 min，70%B；1～2.5 min，70%～95%B；2.5～4.5 min，95%～100%B；4.5～6.0 min，100%～70%B)，流速0.2 mL·min-1；进样体积5 μL。

质谱参数：Waters UPLC H-Clas/Xevo TQD型超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪，电喷雾离子源；正离子检测；毛细管电压：3.0 KV，离子源温度：120 ℃，去溶剂温度：350 ℃，去溶剂流速：600 L·h-1，锥孔电压：30 V，喷雾气与反吹气N2，反吹气流速：50 L·h-1，碰撞气Ar，碰撞气流速：0.16 mL·min-1，碰撞能量：15 V，扫描模式MRM；定量分析特征离子，绞股蓝皂苷A：m/z899.35～814.47，内标丹参酮ⅡA：m/z295.1～206.03。液质系统为 MassLynx V4.1。

2.2 给药方案与血浆样品采集

2.2.1给药方案 参照供试品用法用量，计算60 kg成人日用量为：0.58×2×3÷60≈0.058 g/kg/日。计算大鼠等效剂量：(dA×kB)÷kA=(0.058×0.71)÷0.11≈0.37 g·kg-1，式中，dA为A种动物的给药计量；kA为A种动物等效剂量的折算系数；kB为B种动物等效剂量的折算系数。根据预实验探索结果，调整给药量为灌胃给予0.5 mL·kg-1。实验前禁食不禁水12 h。给药1次。

2.2.2血浆样品采集 根据预试验结果设置取血时间点设置如下：灌胃给药前约0.5 h(零时间)，灌胃给药后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24 h由眼眶静脉丛取血约0.5 mL。置肝素化试管中，轻轻摇匀，4 ℃ 3000 r·min-1离心10 min分离血浆，-80 ℃保存待测。

2.3 血浆样品的预处理

2.3.1空白血浆样品的预处理 取大鼠空白血浆，精密量取50 μL，置1.0 mL塑料离心管中，加入200 μL甲醇，涡旋混匀2 min后，置于离心机中，4 ℃，25 000 r·min-1(离心半径为5.35 cm)离心10 min，取上清液，进行超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS) 分析。

2.3.2含药血浆样品 取大鼠血浆50 μL，精密量取，置1.5 mL 塑料离心管中，加入内标溶液丹参酮ⅡA(100 ng·mL-1，甲醇) 50 μL，涡混1 min，再加入甲醇150 μL，涡混2 min，4 ℃ 25 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样，UPLC-MS分析。

2.4 方法学考察

2.4.1专属性考察 取大鼠空白血浆，分别精密量50 μL，6份，按照2.3.1项下方法操作，经UPLC-MS/MS分析，得空白样品色谱图。将一定浓度的绞股蓝皂苷A对照品溶液和内标丹参酮ⅡA对照品溶液，37 ℃氮气吹干后，加入空白血浆涡旋混匀，依法操作，得相应色谱图。通过比较可以判断大鼠血浆中内源性物质是否干扰待测物的测定。

2.4.2线性关系、检测限与定量限 精密移取各系列绞股蓝皂苷A对照品溶液各50 μL，37 ℃ 氮气吹干后，加入50 μL大鼠空白血浆，涡旋混匀，得绞股蓝皂苷A系列对照品溶液(10、20、50、100、200、400、500 ng·mL-1)，其余按2.3.2项下方法操作。以绞股蓝皂苷A血药浓度为横坐标(C)，绞股蓝皂苷A与内标物的色谱峰面积比值为纵坐标(Y)，以加权系数1/C2进行线性回归，得到标准曲线。

2.4.3准确度和精密度试验 按2.4.2标准曲线和线性范围项下方法分别配制高、中、低浓度(20、100、400 ng·mL-1)的质控样品，同法配制与定量下限(LLOQ)质量浓度(10 ng·mL-1)相当的质控(QC)样品，每个浓度平行分析5次，连续测定3 d，求得方法的日内和日间精密度和准确度。

准确度=(实测浓度/标示浓度)×100%

(1)

2.4.4提取回收率试验 分别取空白血浆50 μL，配制20、100、400 ng·mL-13个质量浓度QC样品，每个浓度平行配制6份，按2.4.2标准曲线和线性范围项下操作方法处理，取5 μL进样，UPLC-MS分析，得绞股蓝皂苷A峰面积A1和内标峰面积A2。

另取空白血浆50 μL，置1.5 mL 塑料离心管中，加入甲醇200 μL，涡混2 min，4 ℃ 25 000 r·min-1离心10 min，得空白血清上清液。取沉淀蛋白后的空白血浆上清液，配制20、100、400 ng·mL-13个质量浓度QC样品，再分别加入50 μL内标溶液，涡旋混合1 min，25 000 r·min-1(离心半径为5.35 cm)离心10 min，取上清液5 μL进样，UPLC-MS分析，得绞股蓝皂苷A峰面积B1和内标峰面积B2。

绞股蓝皂苷A的提取回收率=A1/B1×100%

(2)

内标的提取回收率=A2/B2×100%

(3)

2.4.5稳定性试验 取空白血浆50 μL，配制20、100、400 ng·mL-13个质量浓度QC样品，每个浓度配制6份溶液，进行稳定性考察。

考察条件：QC样品在室温下放置8 h；QC样品在-80 ℃下冻存2个月；QC样品在3个冻-融循环；按2.3.2项下方法处理后的3种质量浓度的QC样品在自动进样器(10 ℃)下放置12 h；储备液在-20 ℃下放置30 d。计算绞股蓝皂苷A在不同稳定性考察条件下的偏差，若偏差在±15%以下，则认为样品稳定[5]。

2.5 基质效应

分别取6份空白血浆样品(来源于6只大鼠)各50 μL，置1.5 mL 塑料离心管中，加入甲醇200 μL，涡混2 min，4 ℃ 25 000 r·min-1(离心半径为5.35 cm)离心10 min，得空白血清上清液。取沉淀蛋白后的空白血浆上清液，配制20、100、400 ng·mL-13个质量浓度QC样品，每个浓度平行配制6份，加入50 μL内标溶液，涡混1 min，4 ℃，25 000 r·min-1(离心半径为5.35 cm)离心10 min，吸取上清液5 μL，进行UPLC-MS/MS分析，得到绞股蓝皂苷A峰面积C1和内标峰面积C2。

取质量浓度为4、20、80 ng·mL-1的绞股蓝皂苷A溶液和20 ng·mL-1的内标溶液，各取5 μL，进行UPLC-MS/MS分析，得到绞股蓝皂苷A峰面积D1和内标的峰面积D2。

绞股蓝皂苷A的基质效应= C1/D1×100%

(4)

内标的基质效应=C2/D2×100%

(5)

若结果在85. 0%～115.%，则认为没有基质效应。

2.6 药动学研究

实验数据采用DAS 3. 0 进行统计分析，分析时用非房室模型进行。

3 结果

3.1 定量离子对的选择

对绞股蓝皂苷A和内标丹参酮ⅡA进行全扫描分析。正离子下，绞股蓝皂苷A能够产生m/z899.35[M+H]+，二级质谱主要碎片为m/z814.47。因此，选择m/z899.35～814.47为绞股蓝皂苷A的定量离子对。同样选择m/z295.1～206.03作为丹参酮ⅡA的定量离子对。

3.2 血浆样品处理方法

比较了几种常规的血浆样品处理方法，其中固相萃取法，可以除掉大部分干扰物质，但价格较为昂贵；沉淀蛋白法，操作简单，重复性好，成本最低。所以，从经济角度考虑，选择了沉淀蛋白法作为本研究中的血浆样品的处理方法[6]。

3.3 分析方法学验证

3.3.1系统适用性与专属性试验 在本研究优化后的色谱条件下，空白血浆色谱图、空白血浆加标准品色谱图和给药后血浆色谱图分别见图2。结果表明，血浆中内源性杂质不干扰绞股蓝皂苷A和内标的测定。

注：A.空白血浆；B.含绞股蓝皂苷A标准物质的空白血浆；C.给药1 h后血浆样品中的绞股蓝皂苷A；D.空白血浆；E.含有内标丹参素ⅡA标准物质的空白血浆；F.给药1 h后血浆样品中的内标丹参素ⅡA。图2 绞股蓝皂苷A和内标丹参素ⅡA的血浆样品典型色谱图

3.3.2标准曲线与最低定量限 以绞股蓝皂苷A血药浓度为横坐标，绞股蓝皂苷A与内标物的色谱峰面积比值为纵坐标(Y)，以加权系数1/C2进行线性回归，得到标准曲线Y=0.001 6X+0.003 2 (r=0.998 4)。结果表明，血浆中绞股蓝皂苷A在10～500 ng·mL-1线性关系良好。方法最低定量限(LLOQ)为10 ng·mL-1(S/N>10)，表明该方法灵敏度较高，可用于绞股蓝皂苷A的定量分析。

3.3.3准确度和精密度 准确度与精密度结果见表1，结果表明，准确度为 97.0%～98.5%，日内精密度RSD<7%，日间精密度RSD<4%。

表1 大鼠血浆中绞股蓝皂苷A UPLC-MS/MS测定的准确度和精密度(n=5)

3.3.4基质效应与提取回收率 提取回收率结果见表2，结果表明，3个浓度提取回收率为84.7%～86.4%，符合生物样本的分析要求，且RSD<4%。基质效应结果表明，内源性物质不干扰绞股蓝皂苷A的测定，且RSD<5%。

表2 绞股蓝皂苷A和内标在大鼠血浆中提取回收率和基质效应考察(n=6)

3.3.5样本稳定性 稳定性试验结果表明，绞股蓝皂苷A在血浆中-80 ℃下冻存2个月、-20 ℃下放置30 d、室温下放置8 h、在自动进样器(10 ℃)下放置12 h、经过3个冻-融循环后基本稳定，不同稳定性考察条件下的偏差均在±15%以下，稳定性良好，结果见表3。

表3 绞股蓝皂苷A在大鼠血浆中不同条件下的稳定性考察(n=6)

结果表明，本研究所建立的大鼠血浆样品分析方法符合药动学研究的相关要求，可以用于绞股蓝皂苷A的大鼠体内药代动力学研究。

3.4 药动学研究

大鼠口服给予葛兰心宁软胶囊后，绞股蓝皂苷A的体内血药浓度-时间曲线见图3。

图3 大鼠口服给予葛兰心宁软胶囊后绞股蓝皂苷A的药时曲线动物数=12)

葛兰心宁软胶囊口服后其主要药效成分绞股蓝皂苷A能够迅速吸收进入血液中，给药后15 min在血中可以检测到绞股蓝皂苷A，并于0.75 h迅速达到最大血药浓度，消除相对较快，半衰期为(6.247±2.039)h。非房室模型分析所得药动学参数见表4。

表4 大鼠口服给予葛兰心宁软胶囊后绞股蓝皂苷A的药动学参数

4 结论

本研究建立了大鼠灌胃葛兰心宁软胶囊内容物后，血浆中绞股蓝皂苷A的 LC-MS/MS 测定方法，并采用非房室模型计算分析了其药动学参数。该方法简单、快捷、灵敏度高、精密度及线性关系良好，可以用于生物样本中绞股蓝皂苷A的药代动力学研究。药动学参数Cmax反映了药物在血浆中的最大浓度，绞股蓝皂苷A的Cmax为(377.6±75.3)μg·L-1，0.75 h迅速达到最大血药浓度，t112为(6.247±2.039)h，CL为(0.249 2±0.050 02)L·h-1·kg-1，清除非常快。绞股蓝皂苷 A 是绞股蓝中含量较高且有效的单体成分[3]，其结构属于达玛烷型四环三萜皂苷。Zhang等[7]报道了大鼠口服绞股蓝总皂苷后，2个达玛烷型四环三萜皂苷类成分gypenoside LⅥ和gypenoside ⅩLⅥ的药代动力参数，半衰期与本研究的结果相近，但是Tmax为4 h，可能与糖基的种类、数量、连接位置不同有关。