金莲花提取物代谢产物研究△

刘斯琪，赵灿，丁鹏敏，陶志，赓迪，王如峰

北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488

金莲花TrolliuschinensisBunge是毛莨科多年生草本植物，主要分布于西南、西北、华北、东北和台湾地区[1]。其干燥花作为中药金莲花(Flos Trollii)入药[2]，味苦，性寒，无毒，具明目、解岚障的功效，主治口疮、喉肿、浮热牙宣、耳疼、目痛[3]。中药金莲花中的主要化学成分包括黄酮、酚酸、生物碱等类成分。其中，黄酮类含量最高，主要为黄酮碳苷，包括荭草苷和牡荆苷及其衍生物[4]；酚酸类成分主要有藜芦酸、苯甲酸、金莲酸、原金莲酸、金莲花苷等[5-6]；生物碱类成分含量最低，主要为金莲花碱[7]。中药化学成分的体内代谢过程对其药效物质的组成有重要影响[8]，而关于金莲花化学成分的体内代谢研究却鲜有报道。由于中药成分经肠吸收最终进入血液的成分较为微量，导致其分析较为困难，许多代谢产物无法被检测到，而且金莲花的主要成分为黄酮碳苷类，较难吸收，进一步增加了检测的难度。为了克服金莲花入血成分及其代谢产物难以检测的缺点，采取分步研究的策略较为实际，即先通过静脉给药方式研究金莲花提取物的体内代谢轮廓，总结代谢规律，在此基础上再对口服给药的血液移行成分进行研究。因此，本研究采用高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱技术(LC-ESI-MS)对金莲花提取物静脉给药后的血液移行成分进行了鉴定和代谢途径分析，为后续的深入研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Waters公司，美国)，Thermo LTQ ORBTTRAP XL质谱仪(Thermo公司，美国)，甲酸，乙腈(Fisher公司，美国)。

1.2 实验动物

清洁级SD大鼠，体质量(200±20) g，由北京斯贝福实验动物科技有限公司提供，合格证编号：SCXK(京)2011-0004。实验前禁食不禁水24 h。

1.3 试药

金莲花药材(批号：20110901)购自河北省安国药材市场，经北京中医药大学王如峰教授鉴定为毛茛科金莲花属植物金莲花TrolliuschinensisBunge的干燥花。取金莲花250 g，加12倍量蒸馏水回流提取2次，每次1 h。合并提取液，过滤，减压浓缩和冷冻干燥后得金莲花总提取物95.5 g。总提取物加适量蒸馏水溶解并稀释成50 mg·mL-1的总提取物溶液，供大鼠静脉给药用。

2 方法

2.1 色谱条件

Phenomenex Synergi Polar-RP色谱柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)，有预柱；流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；梯度洗脱(0～12 min，2%～15%A；12～15 min，15%～27%A；15～27 min，27%～45%A；27～30 min，45%～2%A)；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL。

2.2 质谱条件

Accela 600泵，电喷雾离子源(ESI)，负离子扫描模式，扫描范围m/z：100～1000。毛细管温度：350 ℃，毛细管电压：-35 V，气化温度：300 ℃，鞘流气流量：17 L·min-1。

2.3 给药及采血

实验动物按取血时间分为6个时间点，加上空白对照组，共7个组，每组雌雄各1只大鼠。实验组动物0.004 5 mL·g-1尾静脉注射给药，0.003 5 mL·g-110%水合氯醛腹腔注射的方式麻醉，给药后0、5、15、30、60、90 min下腔静脉取血。

2.4 样品处理

各时间点血样均放置在室温中，2.5 h静置凝出血清，5000 r·min-1离心10 min(离心半径为6.6 cm)，取上清液。雌雄各取0.8 mL血清混合，血清配总提取物组为1.6 mL空白血清，加入50 mg·mL-1总提取物溶液44 μL。上述样品均分别加入3倍量乙腈混合，沉淀蛋白，12 000 r·min-1离心15 min(离心半径为5.6 cm)，取上清液。吸取全部上清液，于37 ℃氮气吹干，再用未吹干前体积的1/20倍甲醇复溶。超声溶解2 min，12 000 r·min-1离心15 min(离心半径为6.6 cm)。吸取上清液备LC-ESI-MS分析用。最终样品为原血清样品浓缩的5倍，血清配总提取物的最终检测质量浓度为6.67 mg·mL-1。

3 结果

各时间点LC-ESI-MS的质谱总离子流图，见图1。

3.1 原型成分质谱裂解规律分析

根据LC-ESI-MS数据分析了酚酸类、黄酮类、生物碱类原型成分在质谱电喷雾离子源(ESI)系统中形成的碎片(表1)，并对其断裂规律进行归纳总结。

酚酸类成分与糖结合的氧苷易断裂，会产生葡萄糖醛酸碎片及其互补离子对，同时还会出现脱羧基的碎片等。

黄酮类成分几乎全部是六碳糖碳苷，其中代表性的碎片为[M-C2H4O2-H]-、[M-C3H6O3-H]-、[M-C4H8O4-H]-、[M-C5H10O5-H]-、[M-C6H12O6-H]-等。荭草素、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、2″-O-(2‴-甲基丁酰基)荭草素及6‴-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷荭草素等均存在荭草素特征离子碎片m/z357、327，而荭草素-2″-O-β-L-吡喃木糖苷与荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的结构基本相同，前者在2″连了1个五碳糖，后者连了1个六碳糖，相差1个CH2O，故其离子碎片基本为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的特征离子碎片减去1个甲氧基。牡荆素、牡荆素-2″-O-β-L-半乳糖苷等均存在m/z341、311等牡荆素特征离子碎片。2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素和3″-O-2-甲基丁酰牡荆素是同分异构体，仅甲基丁酰基的位置不同，均存在m/z323、293，即牡荆素特征碎片失去1分子水。同时，2″-O-(2‴-甲基丁酰基)牡荆素的特征离子碎片也基本为金莲花碳苷Ⅲ减去1个甲基。异槲皮素的碎片中存在m/z151.00和311.12，可能是经逆狄尔斯-阿德尔(RDA)裂解产生的A1，3-离子碎片。

注：A. 大鼠空白血清；B. 血清配总提取物；C. 0 min含药血清；D. 5 min含药血清；E. 15 min含药血清；F. 30 min含药血清；G. 60 min含药血清；H. 90 min含药血清。图1 空白血清、血清配总提取物和含药血清的总离子流图

表1 原型成分结构式及二级碎片信息

续表1

续表1

续表1

续表1

续表1

生物碱类原型成分只检测到了金莲花碱，样品中金莲花碱的提取离子流图显示，保留时间为14.9 min，但是这个时间点的提取离子流图是金莲花碱的硫酸酯化产物m/z298.04。由于硫酸酯键易断裂，因此在提取离子流图中就能提到其最大丰度的二级碎片m/z218.08[M-H]-。金莲花中的金莲花碱在体内的代谢较快，基本被上述提取峰所压制，故在提取离子流图中没有体现。

3.2 代谢产物及代谢规律分析

酚酸类成分的代谢过程大多为结合反应，如藜芦酸、金莲花苷及原金莲酸的羧羟基可与硫酸酯以酯键结合，也可以同甘氨酸以肽键结合。该羧基还可以发生还原反应，还原为醇羟基后，再进行结合。除此之外还会发生O-脱甲基或直接脱甲氧基的现象，O-脱甲基形成羟基后也可发生与葡萄糖醛酸结合及上述其他结合反应。金莲花苷及原金莲酸都易发生ω-氧化，金莲花苷的氧化位置可能为3-位甲氧基，原金莲酸则可能发生于C3侧链末端或C5位[10]。酚酸类成分代谢途径见图2～3，各代谢产物结构及二级碎片信息见表2。

黄酮类成分代谢过程大多为开环裂解过程，可能会发生A型或B型裂解，生成C6-C3及C6-C2型衍生物，其羟基同样会发生葡萄糖醛酸、硫酸酯结合反应或羧基还原成醛后发生甲基结合反应。黄酮类成分代谢途径见图4，各代谢产物结构及二级碎片信息见表3。

金莲花碱多为葡萄糖醛酸、硫酸酯及甲基结合反应，除此之外也可能发生杂环开裂等过程，其代谢途径见图5，各代谢产物结构及二级碎片信息见表4。

注：A.代谢途径一；B.代谢途径二。图2 藜芦酸体内代谢途径

图3 金莲花苷及原金莲酸体内代谢途径

表2 酚酸类代谢产物及二级碎片信息

续表2

续表2

续表2

图4 黄酮类成分体内代谢途径

表3 黄酮类代谢产物及二级碎片信息

续表3

续表3

续表3

续表3

图5 金莲花碱体内代谢途径

表4 生物碱类代谢产物及二级碎片信息

4 讨论

金莲花中的酚酸基本上是以藜芦酸和金莲花苷及其衍生物为主。本研究发现藜芦酸和金莲花苷在体内发生的Ⅱ相代谢[12],以硫酸酯化、甲基化、葡萄糖醛酸化和氨基酸结合反应为主，其中氨基酸一般指的是甘氨酸，这类型代谢产物还会通过酰胺键的断裂再生成新的代谢产物。藜芦酸Ⅰ相代谢的氧化分为甲氧基末端的ω氧化、芳香环上加氧成羟基和环氧化。还原大多指羧基的还原，一般会经历羧基还原成醛最终还原成醇的过程。金莲花苷的氧化除了甲氧基末端的ω氧化和O-脱甲基等外，还有侧链末端的ω氧化、烯键氧化和环氧化。烯键氧化一般会产生羧基，再发生还原，依次生成醛和醇。醛会通过重排生成烯醇，双键环氧化后最终会水解生成2个羟基。除此以外本研究表明,金莲花提取物体内代谢和单体酚酸体内代谢的最大不同在于金莲花提取物能够产生两类酚酸的缩合产物，其中尤以藜芦酸的羧基还原为醇后易发生缩合反应。

金莲花中黄酮类成分以碳苷为主，各成分可以通过水解转化，同时其水解反应也是黄酮类成分在体内的重要反应类型。经静脉注射给药黄酮类成分的主要代谢器官是肝脏，而发生的反应主要是Ⅱ相代谢，包括硫酸酯化、甲基化和葡萄糖醛酸反应，这类反应使原型成分极性增加，利于排泄或者失活。总结研究成果发现，当黄酮母核B环只存在4′位1个羟基时，易发生葡萄糖醛酸反应，当同时存在3′-和4′-2个羟基时，容易同时发生甲基和硫酸酯结合反应，或者是甲基和葡萄糖醛酸结合反应，甲基化一般发生在3′-羟基。黄酮类成分还会发生裂解，这类反应一般是通过肠内菌代谢产生，但是经静脉注射的给药方式并不经过肠代谢，可能的原因是体内存在肝肠循环，能够使经静脉注射给药的中药成分同样拥有与口服给药一样完整的体内代谢。本研究中黄酮类成分在体内的开裂大多为A型或B型开裂2种，A型开裂部位在C环的C4和A环的C5之间，生成C6-C3型(苯丙酸)衍生物和间苯三酚衍生物；B型开裂则发生于C环的C3和C4之间，生成C6-C2型(苯乙酸)衍生物，黄酮醇一般发生B型开裂。黄酮类成分开裂形成的C6-C3型和C6-C2型衍生物和酚酸一样会在体内发生Ⅰ相和Ⅱ相代谢生成对应的代谢产物。

金莲花碱在体内的Ⅱ相代谢也是以甲基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化为主，其他类型的反应应该都与其杂环开裂有关，杂环开裂形成的伯胺又易发生乙酰化反应。