响应面法优化蝉棒束孢SLGY-2产孢条件

张胜兰，邹 晓，商胜华，于晓飞，杨茂发,*

(1. 贵州大学昆虫研究所，贵州省山地农业病虫害重点实验室，贵阳 550025；2. 贵州大学真菌资源研究所，贵阳 550025；3. 贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；4. 贵州大学烟草学院，贵阳 550025)

昆虫病原真菌是最早用于害虫生物防治的病原微生物，在害虫持续控制、环境保护以及药品开发等方面具有独特优势。

蝉棒束孢菌Cordycepscicadae(Kepleretal.，2017)又被称为蝉拟青霉(卫亚丽等，2014)，是一种重要的具有生防潜力的药用资源菌(李忠等，2013)，可寄生膜翅目和鳞翅目中的许多昆虫(邓淑群，1963；陈祝安，1991)。该菌易培养，产孢量大，侵染力强，在害虫防治上有很大的优势(李忠等，2013)。

Yaginuma等(2002)研究蝉拟青霉对桃蛀果蛾Carposinasasakii的毒力影响时，发现此菌对桃蛀果蛾有很强的致病性，有望成为桃蛀果蛾微生物防治的制剂。刘又高等(2007)采用蝉拟青霉孢子粉处理小菜蛾Plutellaxylostella幼虫发现，蝉拟青霉可以在小菜蛾的幼虫和蛹上寄生，并导致其死亡。欧翔(2008)以蝉拟青霉的孢子悬液处理蚕豆蚜虫Aphiscraccivora和小菜蛾的致死率都较高，可达88.7%。陈官菊等(2008)研究发现蝉拟青霉APC20对小菜蛾具有致病力。谭艾娟等(2009)研究发现，4株蝉拟青霉的分生孢子和菌丝对小菜蛾的致病性有一定差异。

此外，有报道表明这类真菌在黄酮类糖苷、类固醇等的生物转化中具有潜在用途(Dymarskaetal.，2017；Ewaetal.，2018；Monikaetal.，2018)，应用前景广阔(Qunetal.，2019)。

斜纹夜蛾Spodopteralitura属鳞翅目夜蛾科，其具有食性杂、世代重叠、抗性强等的特点，防治难度大(罗凯等，2015；唐二平和张传根，2017)。在各类绿色防控技术中，诸如性诱剂及使用药剂防治害虫均有研究报道(罗凯等，2015；唐二平和张传根，2017)，天敌(Luoetal.，2007)、斜纹夜蛾核型多角体病毒Spodopteralituranuclepolyhedrovirus(Thomasetal.，2006)、莱氏野村菌Nomuraearileyi和斯氏线虫Steinernemafeltiae等(宗瑞英，2016)均有成功应用报道。

据报道，棒束孢对菜青虫Pierisrapae(代永东等，2013)、茶卷夜蛾Homonacoffearia和茶小卷夜蛾Adoxophyeshonmai(王定锋等，2014)、小菜蛾(何劲等，2010)、埃及伊蚊Aedesaegypti(Ramirezetal.，2018)、蚜虫Aphid(Liangetal.，2006)、二斑叶螨Tetranychusurticae(Zhangetal.，2016)等都有一定的致病性。鉴于斜纹夜蛾危害的严重性，蝉棒束孢属菌株对鳞翅目等害虫有致病性报道，本文选用一株对斜纹夜蛾相对毒力较好的蝉棒束孢菌株SLGY-2探究其固体培养条件，为今后深入研究昆虫病原真菌棒束孢的孢子扩繁和生物防治应用做些基础工作。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：蝉棒束孢SLGY-2。由贵州大学生命科学学院真菌资源研究所(GZAC)提供，用PDA斜面培养基于冰箱(4℃)保存。

材料：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麦麸、黄豆粉、酵母粉等。

仪器：人工气候箱，恒温培养箱，超净工作台，立式灭菌锅等。

1.2 方法

1.2.1培养基配置和产孢量测定

参照沈萍和陈向东(2007)方法配置以下培养基，PDA基础培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、水1 000 mL；改良PDA培养基1：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麦麸、黄豆粉、酵母粉各2.5 g，共15 g)；改良PDA培养基2：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麦麸、黄豆粉、酵母粉各5 g，共30 g)；改良PDA培养基3：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麦麸、黄豆粉、酵母粉各7.5 g，共45 g)；改良PDA培养基4：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麦麸、黄豆粉、酵母粉各10 g，共60 g)；pH值均为自然，1×105Pa灭菌30 min。

在超净工作台用无菌接种环挑取培养7 d的菌种，在培养基上分别接3个点，约5 mm大小；同样方法分别接入5种改良直径90 mm培养基上，每个处理3个重复；接菌后在培养箱进行培养观察(25℃)，48 h后第1次观察记录，之后每24 h观察1次。第7天用十字交叉法测量菌落直径，然后用0.05%吐温-80无菌水洗脱培养基中的菌丝和孢子粉，刮取孢子液装入离心管充分震荡摇匀30 min，离心管中装入研磨珠以充分打散孢子粉。待分生孢子完全被打散均匀后，用无菌脱脂纱布过滤，弃去杂物和培养基残留物，配成5 mL孢子悬浮液，同样3次重复。最后用血球计数板(25×16型)进行孢子数计数，计算产孢量。

孢子浓度计算方法：计数血球计数板4个角和中央共5个中方格(80个小方格)的孢子数，重复3次求得平均值，血球计数板(25×16型)公式：酵母细胞个数/mL=80个小方格细胞总数/ 80×400×10 000×稀释倍数。

1.2.2不同pH值条件下产孢量测定

同1.2.1在超净工作台将菌株接种在PDA培养基，置于pH值分别为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5条件的生化培养箱(T=25±1℃，RH=75%±5%，L ∶D=18 ∶6)培养。每个处理3个重复，同上观察记录计数。

1.2.3不同温度条件下产孢量测定

同1.2.1在超净工作台将菌株接种在PDA培养基，置于温度分别为10、15、20、25、30℃的生化培养箱(RH 75%±5%，L ∶D=18 ∶6)培养，每个处理3个重复，同上观察记录计数。

1.2.4不同光照时间产孢量测定

同1.2.1在超净工作台将菌株接种在PDA培养基，置于光照时间分别为0 h、6 h、12 h、18 h、24 h生化培养箱(25±1℃，RH 75%±5%)培养，每个处理3个重复，同上观察记录计数。

1.2.5响应面分析及验证实验

在单因素试验条件的基础上，选择培养基营养成分含量、温度、pH值、光照时间4个因素作为响应变量，按照Box-Behnken中心组合设计建立四因素三水平数学模型，以产孢量为响应值，因素与水平编码(表1)。以Design-Expert 8.0的响应曲面法分析得出一个优化条件，重复以上培养基的制备和试验方法，验证试验结果。

表1 因素与水平编码Table 1 Coding of factors and levels

1.3 数据处理

数据采用SPSS 17.0软件进行系统分析，Design-Expert 8.0.6.1软件对数据进行响应面组合及方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素产孢量试验结果

2.1.1不同培养基营养成分含量的产孢量

蝉棒束孢SLGY-2(PDA和改良培养基1)的培养基营养成分含量在0～15 g时，产孢量呈增加趋势，当添加营养成分含量为30 g时，即改良培养基2中的产孢量最多，达到了5.38×108个/mL，显著多于其他配方组，之后在营养成分含量为45～60 g时，产孢量逐渐减少(图1)。

图1 不同培养基营养成分含量的产孢量Fig.1 Spore yield of strain SLGY-2 of media of different nutrient components

2.1.2不同pH值产孢量的测定

在pH值为6.5时，蝉棒束孢SLGY-2的产孢量达到最大，为8.72×107个/mL，显著高于其他pH值试验组。在pH值7.5～9.5范围内产孢量呈现梯度递减，最低仅2.59×107个/mL，各pH值处理间差异显著。pH过酸或过碱都不利于产孢，显著低于其他试验组；在中性值为7.5时的产孢量也未能达到最高。因此，选择pH值为6.5较为适宜(图2)。

图2 不同pH值的产孢量Fig.2 Spore yield of strain SLGY-2 at different pH values

2.1.3不同温度产孢量的测定

菌株SLGY-2产孢量在25℃条件下最高，达到3.86×107个/mL，显著高于其他温度条件下的产孢量。在10℃条件下的产孢量最低，但与15℃、20℃、30℃下的产孢量无显著差异(图3)。

图3 不同温度的产孢量Fig.3 Spore yield of strain SLGY-2 in different constant temperatures

2.1.4不同光照时间产孢量的测定

在全黑暗环境下不利于蝉棒束孢SLGY-2产孢。光照时长在每天6～18 h时，产孢量随着光照时间的延长而增加；光照18 h时，产孢量达到最大值3.87×108个/mL，显著高于其他光照时长处理。至光照24 h产孢量又稍有下降(图4)。

图4 不同光照时间的产孢量Fig.4 Spore yield of strain SLGY-2 in different light: dark cycle

2.2 Box-Behnken响应面试验设计及曲面分析结果

2.2.1响应面试验分析

响应面试验设计结果(表2)。利用Design-Expert 8.0软件对表2中的蝉棒束孢SLGY-2产孢量以及4个因素进行统计分析，得到各单因子的显著性，结果如表3所示；并得到了产孢量(Y)对自变量培养基营养成分含量(A)、pH值(B)、温度(C)以及光照时间(D)的多元二次回归方程为：Y=6.72×108-1.05×107A+2.18×107B+1.63×107C-2.66×106D+1.50×107AB+1.86×107AC+1.07×107AD-7.20×106BC+9.39×107BD-9.84×107CD-3.18×108A2-3.05×108B2-3.12×108C2-2.64×108D2。

表2 Box-Behnken 响应面试验设计结果Table 2 The results of Box-Behnken response surface design

响应面试验方差分析(表3)结果可以看出，方程模型的P<0.0001<0.01，表明该方程模型极显著，方程能很好地拟合试验结果。失拟项P=0.9752>0.05，差异不显著，说明该回归模型的预测值与实测值有较好的拟合水平，该模型适用于对蝉棒束孢SLGY-2产孢条件优化分析和预测。由方差分析可知，二次项培养基营养成分含量(A2)、pH值(B2)、温度(C2)、光照时间(D2)的P值均小于0.0001，达到极显著水平。两两因素交互，pH值与光照时长(BD)和温度和光照时长(CD)的交互作用显著，P值都小于0.05，差异显著。

表3 Box-Behnken 响应面试验方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken response surface design

2.2.2响应面曲面分析

从响应面曲线及等高线图进行分析，可以直观看出优化区域；两两因素交互作用的强弱主要由响应面图的形状呈现出来，响应面图形状陡峭，表示两因素交互作用显著。

从响应面分析图可以直观看出，4个因素两两之间的交互作用对蝉棒束孢SLGY-2产孢量有影响，开始随着两因素的增加而增加，当产孢量达到极值后，逐渐减小。图中的优化区域可以直观看出，从而得到较高的产孢量。(光照时间-pH值)模型和(光照时间-温度)模型的交互作用显著(P<0.05)，随着光照时长的增加和pH值增大，蝉棒束孢SLGY-2的产孢量也随之增加，增加到一定程度时，产孢量有下降的趋势；pH值和光照时长交互作用响应曲面图(图5A)的坡度陡，等高线图(图5B)呈现椭圆形，说明对该菌的产孢量亦呈现先增加后下降趋势。随着光照时长和温度的增加，产孢量也随之增加，到一定值也下降；光照时长和温度交互作用响应曲面图(图6A)的坡度陡，等高线图(图6B)呈现椭圆形，对该菌的产孢量影响显著。

图5 光照时间和pH值对产孢量影响的响应面图(A)和等高线图(B)Fig.5 Response surface map(A)and contour map(B)of the influence of light and pH value on sporulation quantity

图6 光照时间和温度对产孢量影响的响应面图(A)和等高线图(B)Fig.6 Response surface map(A)and contour map(B)of the influence of light and temperature on sporulation quantity

2.2.3产孢条件确定及验证

结合Design-Expert 8.0.6.1软件对数据处理及响应值预测，对响应曲面图和等高线分析，为验证模型预测的准确性及产孢条件的优化，模型中产孢量优化条件为：培养基营养成分含量38.3 g、pH 6.55、25.21℃、光照18.04 h，在该培养条件下，产孢量达到5.70×108个/mL。本研究实际试验测定设定培养基营养成分含量38 g、pH 6.5、25℃、光照18 h验证，重复3次，产孢量的值为5.70(±0.49)×108个/mL。实际测定结果与模型优化条件结果基本相符，可以证明响应面法优化蝉棒束孢SLGY-2产孢条件具有可行性。

3 结论与讨论

微生物的生长需要碳源、氮源以及适宜其生长的环境条件(张文芝和郭坚华，2013)。从本研究结果来看，不同培养基和生长条件对真菌产孢量有较大影响。本试验通过单因素试验和响应曲面分析法对目标菌株蝉棒束孢SLGY-2的培养条件优化。

陈祝安等(1990)采用煮熟的小麦、大麦以及玉米、豆饼、麸皮和谷壳等进行室温固体发酵发现，培养基中的碳源、氮源影响蝉拟青霉的产孢量和孢梗束的生长。狄雪塬(2015)等选用不同培养基配方，YS03球孢白僵菌产孢量最大。本研究在单因素条件中不同培养基营养成分含量在30 g时，可获得最高的产孢量(5.38×108个/mL)。单因素条件选用不同碳源和氮源按1 ∶1的比例，按不同添加量对培养基进行改良。但未对不同碳源和氮源按不同比例对产孢量的影响进行研究，有待继续探索不同比例和不同用量对产孢量的影响。

李忠(2013)对蝉棒束孢LB菌株液体培养特性研究时发现，培养液的pH值影响蝉棒束孢菌丝生长。本实验也发现适宜产孢的最佳pH值为6.5，pH值在4.5时，培养基不凝固，不能进行接菌培养；当pH值在9.5时培养基凝固，但蝉棒束孢SLGY-2生长缓慢且产孢极少；偏酸或偏碱性都不利于产孢。适宜温度为25℃，与许明敏(2012)以Richard液为培养基25℃适宜产孢相近；当温度低于15℃或高于30℃时菌株生长慢且未能见明显孢子粉，不利于产孢。全黑暗时产孢也未见明显孢子粉，最适光照时间为18 h，光照时长影响蝉棒束孢产孢量。结合响应曲面分析法对蝉棒束孢SLGY-2的培养条件进行探究，产孢量较单因素的条件有所提高。

本文从固体培养条件的优化对其产孢量的影响进行探究，运用响应曲面分析法探究培养基营养成分含量、pH值、温度以及光照时间4个因素对蝉棒束孢SLGY-2产孢量的影响。经过响应曲面分析产孢量最优组合：培养基营养成分含量38.3 g、pH 6.55、25.21℃、光照18.04 h。适宜于为进一步探究蝉棒束孢固体培养条件的优化。