四环素对孤雌产雌松毛虫赤眼蜂生殖表型及适合度的影响

霍梁霄，周金成，张 琛，赵 倩，董 辉

(沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110161)

Wolbachia是一类广泛分布于节肢动物类群和线虫中、随母系遗传的专性胞内共生菌(Werrenetal.，2008)。Wolbachia能够调控宿主生殖表型改变，主要包括：细胞质不亲和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)、雌性化(Feminization)、杀雄(Male Killing，MK)和诱导孤雌产雌生殖(Parthenogenesis Induction，PI)(Werren，1997；施婉君等，2002)。另一方面，Wolbachia还影响雄性黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的侵略性(Rohrscheibetal.，2015)和活跃状态(Vale and Jardine，2015)、提高宿主的免疫力(Hedgesetal.，2008)、参与到缩基反颚茧蜂Asobaratabida的卵子发生过程(Dedeineetal.，2005)和提高松毛虫赤眼蜂Trichogrammadendrolimi的功能反应(Dongetal.，2017)。通过利用Wolbachia对宿主的这些调控作用，可以实现对宿主生物的改造，从而达到控制有害生物或提高天敌防治潜力的作用(Werrenetal.，2008；Brucker and Bordenstein，2012；Le Page and Bordenstein，2013)。因此，Wolbachia与宿主之间的互作一直是近年来研究的热点。

由于胞内共生菌Wolbachia无法在宿主细胞外生存，这种特性增加了研究共生菌Wolbachia的困难(Werrenetal.，2008)。一般而言，通过抗生素处理能够获得Wolbachia去除或滴度降低的宿主种群，可用以研究Wolbachia对宿主的调控作用。目前，最常用的抗生素是四环素，其次是利福平(Lietal.，2014)。Dobsonetal.(2002)借助四环素探究了Wolbachia对宿主白纹伊蚊Aedesalbopictus的影响。Wangetal.(2017)通过四环素处理丽蚜小蜂EncarsiaFormosa，证明Wolbachia密度可以影响宿主的性别决定。Almeidaetal.(2010)利用利福平去除一种赤眼蜂T.atopovirilia体内的Wolbachia，用以研究Wolbachia对宿主行为的影响。高温、密集饲养和营养胁迫处理也能够降低Wolbachia滴度(Wiwatanaratanabutr and Kittayapong，2009；Zhuetal.，2012；Rossetal.，2016)，但这些方法均不如抗生素处理普遍。研究者们大多只关注抗生素处理后对Wolbachia介导下宿主相关表型的影响，然而抗生素处理也可能对宿主的适合度产生影响。抗生素处理下宿主适合度的变化以及宿主体内Wolbachia滴度的变化均有可能影响宿主表型。为排除抗生素对宿主的“附加效应”，抗生素处理感染宿主时应当考虑对宿主适合度的潜在影响。

赤眼蜂是一种广泛应用于生物防治的鳞翅目害虫卵期寄生蜂，其性别决定方式为单双倍体决定型，即二倍体受精卵可发育为雌蜂，未受精的单倍体卵可发育为雄蜂(潘雪红等，2007)。然而，Wolbachia可诱导赤眼蜂发生孤雌产雌生殖现象(Stouthameretal.，1993；Arakakietal.，2000；Russell and Stouthamer，2011；Reumeretal.，2012)，即未受精的卵恢复二倍体发育成雌蜂。前人研究发现抗生素处理可以恢复感染赤眼蜂的两性生殖(Stouthameretal.，1990)，但是抗生素对赤眼蜂适合度的影响尚不清楚。本研究采用不同浓度的四环素连续饲喂产雌孤雌生殖的松毛虫赤眼蜂5个世代，观察统计各世代下不同浓度四环素处理后松毛虫赤眼蜂的繁殖力(黑卵数)、羽化率(羽化出蜂的数量占黑卵数的比值)及子代雄蜂比(子代雄蜂占子代数量的比值)，探究四环素处理对松毛虫赤眼蜂适合度的影响，为研究Wolbachia与寄主之间相互作用的机制提供一种技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

产雌孤雌生殖的松毛虫赤眼蜂及其寄主米蛾Corcyracephalonica均来自于沈阳农业大学农业昆虫与害虫生物防治实验室。孤雌产雌生殖的松毛虫赤眼蜂由人工转染Wolbachia获得，并用新鲜米蛾卵在室内(25±1℃，RH 75%±5%，16 L ∶8 D)连续饲养多代。

寄主米蛾在养虫室内(25±1℃，RH 75%±5%，16 L ∶8 D)用面粉繁育多代。试验前取新鲜的米蛾卵(<24 h)粘在涂有阿拉伯树胶的白色纸卡上，制成米蛾卵卡。米蛾卵卡用紫外灯照射处理40 min，以便杀死胚胎防止米蛾卵孵化吃掉被寄生的卵，影响实验结果。处理后的米蛾卵卡供松毛虫赤眼蜂寄生。试验所用的四环素购于大连宝生物公司，所用蜂蜜为荆条蜂蜜，购自沈阳农业大学沈农宝蜂蜜有限公司。

1.2 方法

将50 mg、150 mg、250 mg四环素分别溶于10 mL 50%蜂蜜水，配制成四环素浓度分别为5 mg/mL、15 mg/mL、25 mg/mL抗生素-蜂蜜水溶液,存于4℃冰箱中备用。

随机选取羽化时间一致(<24 h)的赤眼蜂作为供试蜂，供试蜂分为4组，每组设20个重复，其中1组为对照组，喂食不含四环素的50%蜂蜜水；其余3组分别喂食含有浓度为5 mg/mL、15 mg/mL、25 mg/mL四环素的蜂蜜水。为保证供试蜂能够充分接触并取食蜂蜜水，预先用与指型管等长的棉线蘸取蜂蜜水后移入指型管(直径1.0 cm，长度4.5 cm)，保证棉线沿管口至管底延伸，使随后接入的供试蜂能够充分接触并取食棉线上的蜂蜜水。供试蜂引入至指型管喂食蜂蜜水12 h后，把米蛾卵卡(卡上约100粒卵)放入指型管内，供其寄生。为防止羽化出的子代雄蜂与子代雌蜂交配，被寄生的米蛾卵从最初的淡黄色变成黑色(赤眼蜂正在蛹期)，将单粒黑卵剪下置于指形管中，剩下的黑卵置于原指形管中。赤眼蜂羽化后(F1代)，对单粒黑卵羽化的雌蜂重复上述操作至F5代。统计各世代下赤眼蜂的繁殖力(黑卵数)。根据触角形态和外生殖器鉴定子代性别，在双目显微镜下观察并记录各世代下子代性别及子代个数。统计各世代松毛虫赤眼蜂羽化数、羽化率(羽化出蜂的数量占黑卵数的比值)、雄蜂数、雄蜂率(子代雄蜂占子代数量的比值)。

1.3 数据分析

试验结果采用双因素方差分析，检验了不同世代下的四环素不同浓度处理对松毛虫赤眼蜂繁殖力、羽化率以及雄性比的影响。采用Breusch-Pagan检验对数据的正态性和方差一致性假定进行检验。各世代下不同四环素处理下各试验指标间的多重比较采用Duncan’s新复极差检验。所有数据结果采用SPSS 19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 四环素和处理世代对繁殖力的影响

与对照组相比，各世代中不同浓度四环素处理的雌蜂繁殖力均显著降低(P< 0.05)(图1)。不同世代的对照组雌蜂繁殖力无显著差异，在60～70粒之间。四环素不同浓度和处理世代对雌蜂繁殖力具有交互作用影响。在F1代、F2代和F5代中，雌蜂繁殖力随四环素浓度的增加而下降，但在F3代和F4代中，抗生素浓度对雌蜂繁殖力无显著差异(P> 0.05)。各世代下雌蜂繁殖力在F2代达到最高，但在F3代达到最低。

图1 四环素浓度和处理世代对繁殖力的影响Fig.1 The fecundity as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：图中误差柄为平均值±标准误。不同字母表示各世代下不同浓度四环素处理下的繁殖力在0.05水平上差异显著性。Note: The errorbars represent the Mean±SE. Different letters represent the significant difference of fecundity in each concentration in the same generation at 0.05 level.

2.2 四环素和处理世代对子代羽化率的影响

与对照组相比，各世代中不同浓度四环素处理对子代羽化率的影响不具有一致性(图2)，F2和F4代四环素处理的子代羽化率显著低于相应对照组(P< 0.05)，但F1、F3和F5代四环素处理的子代羽化率与对照组相比无显著差异(P>0.05)。各世代相应对照组的子代羽化率基本一致，其子代羽化率在80%到90%之间。在F2代中，5 mg/mL的四环素处理后，子代羽化率最低，为64.87%±1.14%。在F4代中，15 mg/mL和25 mg/mL的四环素处理后，子代羽化率最低，分别为60.03%±2.33%和58.43%±2.33%。

图2 四环素浓度和处理世代对子代羽化率的影响Fig.2 The emergence rate of offsprings as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：图中误差柄为平均值±标准误。不同字母表示各世代下不同浓度四环素处理下的羽化率在0.05水平上差异显著性。Note: The errorbars represent the Mean±SE. Different letters represent the significant difference of emergence rate in each concentration in the same generation at 0.05 level.

2.3 四环素和处理世代对子代雄性比的影响

不同浓度四环素连续处理松毛虫赤眼蜂5代后，各世代下均出现了雄性后代(图3)。在F1代中，15 mg/mL的四环素处理的子代雄性比达到最高，为6.07%±1.87%，其余浓度处理组子代雄性比与对照组之间无显著差异(P>0.05)。相同浓度的四环素处理下，F2代子代雄性比显著高于F1代(P< 0.05)。F2代中，各浓度处理组的子代雄性比之间无显著差异(P>0.05)。相同四环素处理浓度下，F3代子代雄性较F2进一步显著上升(P< 0.05).在F3代中，5 mg/mL和15 mg/mL四环素处理的子代雄性比较高，分别为33.28%±7.08%和33.03%±6.64%。F4代中，5 mg/mL和15 mg/mL四环素处理的子代雄性比与F3代相比无显著差异(P>0.05)，但25 mg/mL四环素处理的子代雄性比达到最高，为87.02%±5.40%。F5代中，5 mg/mL和15 mg/mL四环素处理的子代雄性比与F3和F4代相比又进一步上升(P< 0.05),但25 mg/mL四环素处理的子代雄性比与F4代相比显著下降(P< 0.05)。

图3 四环素浓度和处理世代对子代雄性比的影响Fig.3 The male ratio of offsprings as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：图中误差柄为平均值±标准误。不同字母表示各世代下不同浓度四环素处理下的雄性比在0.05水平上差异显著性。Note: The errorbars represent Mean±SE. Different letters represent the significant difference of male ratio in each concentration in the same generation at 0.05 level.

3 结论与讨论

从恢复松毛虫赤眼蜂两性生殖表型的角度上，不同浓度四环素处理松毛虫赤眼蜂1个世代并不能达到预期效果。较低浓度的四环素对松毛虫赤眼蜂两性生殖表型的恢复效果(子代雄性比)随处理世代增加而提升。然而，高浓度四环素处理下，松毛虫赤眼蜂两性生殖表型的恢复效果在前4个世代中随处理世代的增加而上升，但在第5个世代中子代雄性比回落。总体而言，各浓度四环素连续处理2个世代后才会对松毛虫赤眼蜂两性生殖表型有显著的恢复作用。在恢复松毛虫赤眼蜂两性生殖表型的条件下，还需进一步选择对松毛虫赤眼蜂适合度影响最小的四环素处理方式。

本文通过研究繁殖力和羽化率来检验抗生素对松毛虫赤眼蜂的“附加效应”。在松毛虫赤眼蜂恢复两性生殖表型的基础上，从繁殖力角度上看，四环素连续处理赤眼蜂2个世代对雌蜂繁殖力影响最小。四环素对雌蜂繁殖力的影响随世代的增加具有累加效应(图1)。从松毛虫赤眼蜂子代的致死作用(羽化率)的结果得知，四环素连续处理雌蜂3个世代对松毛虫赤眼蜂羽化率影响最小(图2)。因此，综合抗生素对羽化率和繁殖力的影响，应当选用较低的抗生素浓度处理松毛虫赤眼蜂2个世代或3个世代。

业已证明，抗生素可以用于降低宿主体内的Wolbachia滴度，进而削弱Wolbachia对宿主生殖表型的调控能力。因此，通过抗生素处理的宿主能够用于确定Wolbachia调控宿主相关表型表达的一种技术手段。Maetal.(2015)研究发现一种产雌孤雌的寄生蜂A.japonica的子代雄蜂比例随着Wolbachia滴度的降低而增加。有研究发现产雌孤雌生殖的丽蚜小蜂子代雄性比例也随着Wolbachia滴度降低而增加(Stouthamer and Mak，2002)。在赤眼蜂中，这类现象也已被证明。陈茜等(2016)发现产雌孤雌生殖的食胚赤眼蜂T.embryophagum雄蜂比例随着Wolbachia滴度的降低而增加。许多这类研究均指出，Wolbachia滴度与控制宿主生殖表型的表达之间存在正相关关系(Breeuwer and Werren，1993；Bourtzisetal.，1996；Zchori-Feinetal.，2000；Ikedaetal.，2003；Pascaletal.，2004)。Stouthamer(1997)认为通过抗生素等手段降低宿主体内的Wolbachia滴度，可以削弱Wolbachia对宿主卵细胞第一次有丝分裂的干扰作用，使胚胎配子复制失败，进而使宿主仍然维持胚胎染色体的单倍状态，最终发育为雄性个体。

从结果中发现四环素处理孤雌产雌生殖的的松毛虫赤眼蜂后，雌蜂繁殖力低于对照组，各世代下雌蜂繁殖力随四环素浓度的增加而下降。四环素能够影响松毛虫赤眼蜂的寄生功能，导致雌蜂寄生能力降低。造成这种结果的原因可能由于以下三个方面：(1)四环素处理感染宿主可以引起Wolbachia滴度的变化，导致感染宿主的适合度发生改变。基因冲突假说认为，在宿主胚胎中，Wolabchia和宿主基因存在博弈关系。单倍体宿主的核基因仍然趋向于使宿主发育为雄性子代，而Wolbachia趋向于使宿主第一次有丝分裂失败，促使胚胎染色体加倍。双方的这种竞争关系将造成宿主产生一定的适合度代价，而较低的Wolbachia滴度将使这种“拉锯战”的时间延长，进而对宿主适合度造成负面影响，甚至使宿主胚胎“败育”。有研究表明，在这种博弈关系下，孤雌产雌生殖的赤眼蜂胚胎的流产率显著高于两性生殖的赤眼蜂胚胎(Tagamietal.，2001)。相关研究发现，Wolbachia感染下的蚬蝶赤眼蜂T.kaykai的繁殖率和羽化率均显著降低(Hohmannetal.，2001；Miura and Tagami，2004)。Liuetal.(2018)发现Wolbachia对松毛虫赤眼蜂的适合度存在负面影响。(2)四环素的作用机制为阻断原核生物30S核糖体亚基，进而抑制转录及蛋白合成。因此，四环素可能对宿主线粒体的蛋白质合成产生抑制作用(Zhangetal.，2005)。前人研究发现四环素会降低拟果蝇D.simulans体内线粒体的功能，减少宿主ATP产物的合成，从而影响拟果蝇的生殖力和寿命(Ballard and Melvin，2007)。(3)抗生素在清除Wolbachia靶标微生物的同时，可能也对宿主体内的其他共生微生物产生负面影响，导致宿主体内菌群失衡。一些共生菌也可能与宿主共用代谢通路，参与宿主维生素及其他营养成分的合成(Lvetal.，2018)。因此，抗生素处理感染宿主时，应充分考虑抗生素处理的非靶标作用。

根据研究结果推测，在特定抗生素浓度处理下，随抗生素处理宿主代数的增加，抗生素也可能对宿主产生毒物兴奋作用(Daviesetal.，2006；Linaresetal.，2006；Miglioreetal.，2013)。宿主可能在前期对抗生素的适应性较差，但随处理世代的增加，宿主赤眼蜂体内解毒功能逐步激活，适合度有所恢复。然而，宿主对适合度的恢复能力可能不具有持续性，若继续增加处理世代数，其适合度变化将再次出现反复。根据赤眼蜂羽化率的变化情况，推测四环素处理感染Wolbachia的赤眼蜂后，各世代下的雌蜂对不同四环素浓度的耐受能力不同，雌蜂在低浓度的抗生素条件下能够进行自我修复一部分损伤，而高浓度抗生素处理对宿主造成的损伤具有不可逆性。

通过抗生素处理宿主来研究共生菌对宿主相应功能表型的影响是一种模式方法。但在进行这类研究中，应当考虑排除或降低抗生素对宿主生殖表型影响之外的非靶标作用影响。本研究将对这类研究方法的严谨性和科学性提供新的工作思路和数据支持。在抗生素使用量能够恢复松毛虫赤眼蜂两性生殖表型的基础上，本试验结果能够为四环素去除Wolbachia提供推荐使用量和使用方法，从而使抗生素对宿主赤眼蜂的“附加效应”影响最小。关于抗生素的使用量还有待于明确，有关这类研究应当更加全面和深入的开展。