水椰八角铁甲不同日龄和性别成虫表皮碳氢化合物的种类及动态

蒲宇辰，向海军，黄 斌，侯有明*

(1. 福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福州 350002；2. 福建农林大学植物保护学院福建省昆虫生态学重点实验室，福州 350002；3. 闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000；4. 菲鹏生物股份有限公司，广东东莞 523808)

水椰八角铁甲Octodontanipae(Maulik)隶属于鞘翅目Coleoptera、叶甲科Chrysomelidae、潜甲亚科Anisoderinae、隐爪族Cryptonichini，最早起源于马来西亚(Maulik, 1921)，我国于2001年在海南省东方市江南苗圃内的华盛顿棕榈Washingtoniafilifera上首次发现该虫的踪迹(孙江华等, 2003)，并已于2013年将其列入全国林业危险性有害生物名录(国家林业局, 2013)。目前，该虫已入侵扩散至我国福建、海南、广东、广西、云南等南方的多个省份，并成功定殖(孙江华等, 2003; Hou and Weng, 2010)。其幼虫和成虫主要取食为害加拿利海枣Phoenixcanariensis、银海枣P.sylvestris、刺葵P.hancea、椰子Cocosnucifera、蒲葵Livistonachinensis、槟榔Arecacatechu、假槟榔Archontophoenixalexandrae等多种棕榈科植物未完全展开的心叶，使叶片呈现褐色的条斑、皱缩或卷曲，严重影响了入侵地的棕榈产业和园林景观，造成显著经济和观赏价值损失(Hou and Weng, 2010; 张秩勇, 2010; 张翔, 2015)。

昆虫表皮碳氢化合物(cuticular hydrocarbons, CHCs)是稳定存在于昆虫上表皮蜡质层中的含碳数一般为20～50不等的长链烃类混合物，包括直链饱和烃、直链不饱和烃、支链饱和烃和支链不饱和烃(Blomquist and Dillwith, 1985; Lockey, 1988)。现有研究表明，昆虫表皮碳氢化合物的组分和含量具有物种特异性，因此它们已被广泛应用于蜜蜂、蚂蚁、白蚁、棉铃虫Helicoverpaarmigera、烟青虫Heliothisassulla等多种昆虫的分类研究中(高明媛等, 1999; 张红兵等, 2005; 梁小松等, 2009)。然而表皮碳氢化合物在近缘种、乃至同一物种不同个体之间也可能存在差异(Blomquistetal., 1979)。据杨锦锦等(2015)报道，黑翅土白蚁Odontotermesformosanus的表皮碳氢化合物具有品级特征，工蚁、兵蚁、幼蚁和生殖蚁的表皮碳氢化合物的种类相同，但含量存在差异。Xue等(2016)还发现，叶甲科跳甲属Altica个体表皮碳氢化合物的种类和含量依性别、虫龄、交配与否、性成熟与否等自身因素而异。此外，昆虫表皮碳氢化合物的组分和含量也会受外界环境因子的影响，例如已有报道表明食物因素可以引起桔小实蝇Bactroceradorsalis的种内表皮碳氢化合物组分的改变(雷妍圆等, 2017)。

在许多昆虫中，表皮碳氢化合物还是一类重要的信息化合物，可以充当化学信号线索，参与生物个体之间的亲系识别和配偶选择(Martin and Drijfhout, 2009; Steigeretal., 2015; Laneetal., 2016)。Kirchner和Minkley(2003)研究表明，草白蚁Hodotermesmossambicus可以通过交哺表皮碳氢化合物来区分同巢幼蚁和异巢幼蚁。这进一步说明表皮碳氢化合物是巢间识别中可以相互传递的一类重要信息物质。而在蟋蟀雄雄竞争和雌性配偶选择中的研究表明，昆虫在配偶选择过程中，相同环境下不同个体之间表皮碳氢化合物通常具有不同的表观遗传，配偶之间可以利用这种差异评估遗传相似性(Kortet and Hedrick, 2005; Thomas and Simmons, 2008; Steigeretal., 2015)。因此，雌性可以依赖于自身表皮碳氢化合物作为化学模板去感知潜在配偶的化学模板，然后评估配偶质量来决定是否交配，一旦交配则会引起配偶双方表皮碳氢化合物的变化，这样就可以避免近亲交配或多次交配(Capodeanu-Nägleretal., 2014)。在蟋蟀Teleogryllusoceanics中，雌性个体更倾向于与那些拥有相异表皮碳氢化合物谱的个体进行交配，而且配偶之间的表皮碳氢化合物谱相似性与遗传相似性呈正相关(Thomas and Simmons, 2011)，这说明个体的表皮碳氢化合物谱能够反映它们的遗传质量，从而作为配偶选择的信号来影响交配双方的吸引力(Steiger and Stokl, 2014)。

水椰八角铁甲作为一种入侵害虫，具有聚集为害和世代重叠等生物学特性(Hou and Weng, 2010)，而昆虫表皮碳氢化合物能够提供与日龄、性别和物种分化相关的重要信息(张红兵等, 2005; Xueetal., 2016)。然而国内外对该虫表皮碳氢化合物的研究尚未见报道。为此，本研究基于化学生态学，应用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术，利用整体化学浸提(萃取)法和液体进样法，对不同日龄和不同性别的水椰八角铁甲成虫个体的表皮碳氢化合物进行检测，在确定表皮碳氢化合物组分的基础上，分析不同日龄和不同性别间个体表皮碳氢化合物的差异，旨在明确个体因素对该虫表皮碳氢化合物组分与含量的影响，以期为近缘种的种类识别及该虫的日龄、性别和性成熟与否的快速鉴定及其检验检疫监测提供新的技术手段和详实可靠的数据支持。同时，本文也为进一步研究昆虫的配偶选择机制奠定理论基础，从而可为开发以昆虫表皮碳氢化合物为靶标的新型害虫抑制剂或行为干扰剂提供新的思路和途径。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫的采集及饲养

供试水椰八角铁甲虫源采自福建省漳州市漳浦县台湾农民创业园(24.18°N，117.40°E)，寄主为加拿利海枣。在实验室内，将采集到的野外种群饲养于瓶底垫有滤纸的组织培养瓶(直径6 cm，高9 cm)中。从福建省福州市城市绿化带采集加拿利海枣叶片用于饲养水椰八角铁甲，每3 d更换一次新鲜的叶片。幼虫化蛹后，挑取单头蛹置于单个指形管(直径1.5 cm，高7 cm)内，直至羽化为成虫，并用于后续试验。该虫的饲养条件为温度25±1℃，RH 50%±10%，光暗周期L ∶D=12 ∶12。所有试验均在可精确控温控湿的人工气候箱中进行。

1.2 试验试剂和仪器

主要仪器和耗材：7890A-5975B气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；N2低温吹填蒸发浓缩装置(长沙自动化仪表厂)；石英毛细管色谱柱HP-5MS(0.25 mm×30 m×0.25 μm)(美国Agilent公司)；2 mL棕色色谱进样瓶(美国Agilent公司)；5 mL一次性塑料医用注射器(康友牌)；0.22 μL微孔滤膜(PALL)等。

主要试剂：99.8%色谱纯正已烷(Aladdin)；C7-C40正构烷烃混合标样(Sigma-Aldrich)；C18正构烷烃标样(Dr. Ehrenstorfer)等。

1.3 水椰八角铁甲成虫表皮浸提物样品的制备

分别选取5头羽化1 d、5 d、10 d和15 d的水椰八角铁甲雌成虫或雄成虫，先用液氮迅速冷冻2 min致死，然后用超纯水清洗3遍，再用滤纸吸干水分。其中，15日龄为该虫的性成熟阶段(张翔, 2015)。将处理过的5头试虫作为一个样品放入2 mL色谱进样瓶内，加入1 mL色谱纯正己烷浸泡10 min。将提取液转移至另一个2 mL进样瓶中，再用套上0.22 μL微孔滤膜的5 mL一次性塑料医用注射器过滤至第3个2 mL进样瓶中。最后将含有表皮浸提物的2 mL进样瓶置于通风橱内，用纯N2低温蒸发2 min，待正己烷蒸发完全后再加入200 μL含有正十八烷(100 ppm)内参的正己烷，定量后清洗瓶壁，置于-20℃中保存备用。而后进行气相色谱-质谱联用检测，以定性鉴定和定量分析水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的组成成分及其含量。每种处理进行5次生物学重复。

1.4 仪器分析条件

GC-MS升温条件如下：起始温度50℃，保持2 min，然后以23℃/min的速率升至280℃，再以2 ℃/min的速率升至310℃，保持10 min，整个程序共37 min。以高纯氦气作为载气，流速为1 mL/min，柱压为7.652 psi。电子轰击离子源(EI)的电子能量70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度为150℃。进样口温度290℃，采取不分流模式。质谱扫描范围为m/z 40～650。GC与MS之间连接温度为300℃，溶剂延迟2 min。

1.5 数据分析

1.5.1表皮碳氢化合物的定性分析

首先通过气相色谱的分离，得到水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的总色谱图和各分离组分的出峰保留时间，然后按照Kovts(1965)的方法计算各组分的科瓦茨保留指数(Kovts Index, KI)。将获得的质谱图离子碎片和各组分的保留时间与C7-C40标准品的保留时间进行比对，在NIST11数据库中检索，初步确认表皮碳氢化合物的结构。同时也将保留指数、特征离子峰和荷质比等参数信息与已发表文献所提供的表皮碳氢化合物进行比对(Gohetal., 1993; 雷妍圆等, 2017)，从而确定水椰八角铁甲表皮碳氢化合物的种类。

1.5.2表皮碳氢化合物的定量分析

根据水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的总色谱图，分别对每一种表皮碳氢化合物的出峰面积进行积分，获得相应的各组分峰的面积(峰面积或峰高与组分的含量成正比)，再除以同条件下正十八烷内参的积分面积来得到相对面积比率。将所有相对面积比率乘以内参正十八烷的含量即得每种碳氢化合物的绝对含量，以此作为试虫表皮碳氢化合物混合物中各组分的定量指标。其中，正十八烷绝对含量减去内参含量等于水椰八角铁甲自身的含量。

1.5.3不同日龄和不同性别的水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的组成比较

所有试验数据的统计分析利用SPSS 21.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)进行。其中，相同性别不同日龄的水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物绝对含量间的差异显著性检验采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey HSD多重比较的方法，而对相同日龄的水椰八角铁甲雌成虫和雄成虫之间表皮碳氢化合物绝对含量的差异性比较则采用独立样本t检验(independent-samplettest)进行。显著性水平α均为0.05。

2 结果与分析

2.1 水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的种类

不同日龄和不同性别的水椰八角铁甲成虫的表皮碳氢化合物在组分上不存在差异，皆含有相同种类的正构烷烃、单甲基烷烃、多甲基烷烃、正构烯烃、单甲基烯烃和环烷烃等共6大类21种碳氢化合物，它们的碳链长度从18到30不等(表1)。其中，正构烷烃的种类在所有碳氢化合物中的占比最大，为52.38%。其次是正构烯烃和环烷烃，皆占所有碳氢化合物种类的14.29%。种类最少的为单甲基烷烃(9.52%)、多甲基烷烃(4.76%)和单甲基烯烃(4.76%)等支链碳氢化合物。这一结果表明，水椰八角铁甲成虫的表皮碳氢化合物以正构烷烃等含碳数为20～30不等的直链饱和烃为主。

表1 水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的组成成分Table 1 Components of cuticular hydrocarbons in Octodonta nipae adults

续表1 Continued table 1

2.2 不同日龄的水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物含量的动态变化

在21种水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物中，不同日龄的雄虫只有5种化合物的含量发生了显著变化，分别是正二十四烷(F3,16=5.573，P<0.05)、正二十六烷(F3,16=13.336，P<0.01)、2-甲基十九烷(F3,16=6.902，P<0.05)、10-甲基二十烷(F3,16=6.245，P<0.05)和1-二十烯(F3,16=12.019，P<0.01)(图1)。其中，正二十四烷(最高156.89 ng/5头)、正二十六烷(最高878.69 ng/5头)和1-二十烯(最高832.19 ng/5头)的平均绝对含量于10日龄前皆不存在显著差异，10日龄后开始显著上升，在15日龄性成熟时达到最大，此时相对含量分别为1.15%、6.42%和6.08%。而2-甲基十九烷和10-甲基二十烷在不同日龄间的动态变化规律一致，它们的含量在刚羽化时(1日龄)最高，平均绝对含量分别为2 189.64 ng/5头和2 668.15 ng/5头，相对含量分别为15.35%和18.70%，随后开始显著下降，5日龄、10日龄和15日龄之间没有显著差异。

图1 水椰八角铁甲雄性成虫存在差异的表皮碳氢化合物的绝对含量在不同日龄之间的变化Fig.1 Changes of the absolute content of cuticular hydrocarbons with significant difference in different ages of Octodonta nipae male adults注：图中数据为平均值±标准误。不同的小写字母表示相同的表皮碳氢化合物在不同日龄的成虫中的绝对含量存在显著差异(P<0.05)。下图同。Note: Data are shown as mean±standard error (SE). Different small letters indicate that there are significant differences to absolute contents among adults of different ages with the same cuticular hydrocarbons. The same below.

然而，不同日龄的水椰八角铁甲雌性成虫之间含量发生显著变化的表皮碳氢化合物共有12种，分别是正二十烷(F3,16=19.149，P<0.001)、正二十一烷(F3,16=5.391，P<0.05)、正二十三烷(F3,16=6.222，P<0.05)、正二十四烷(F3,16=7.274，P<0.05)、正二十六烷(F3,16=7.274，P<0.05)、正二十八烷(F3,16=6.758，P<0.05)、正三十烷(F3,16=4.799，P<0.05)、2-甲基十九烷(F3,16=5.391，P<0.05)、2,6,10,15-四甲基二十一烷(F3,16=12.350，P<0.01)、1-二十烯(F3,16=90.392，P<0.001)、反式-10-二十一烯(F3,16=8.388，P<0.01)和5-甲基-5-顺式-二十二烯(F3,16=4.769，P<0.05)(图2)。其中，在刚羽化(1 d)至性成熟(15 d)期间，正二十烷、正二十一烷、正二十三烷、正二十六烷、2-甲基十九烷、2,6,10,15-四甲基二十一烷、1-二十烯和反式-10-二十一烯的含量的动态变化趋势基本相似，虽然这些化合物的含量在羽化5 d、10 d和15 d的雌成虫之间不存在显著差异，但是皆显著低于1日龄时的含量，即它们的平均绝对含量和相对含量在刚羽化时最高，分别是854.09 ng/5头(6.15%)、1 282.67 ng/5头(9.24%)、824.91 ng/5头(5.94%)、831.68 ng/5头(5.99%)、1 455.24 ng/5头(10.48%)、1 560.58 ng/5头(11.24%)、846.09 ng/5头(6.09%)和888.06 ng/5头(6.40%)。 与1日龄(137.15 ng/5头)相比，5日龄(21.69 ng/5头)和15日龄(13.64 ng/5头) 表皮正二十四烷的平均绝对含量皆显著降低。而正二十八烷的含量在10日龄时才开始显著低于1日龄时的含量，平均绝对含量分别是75.75 ng/5头和456.17 ng/5头，相对含量分别为2.11%和3.29%。此外，正三十烷和5-甲基-5-顺式-二十二烯的绝对含量只有在羽化1 d(分别是100.83 ng/5头和185.60 ng/5头)和羽化10 d(分别是21.91 ng/5头和26.58 ng/5头)之间存在差异。

图2 水椰八角铁甲雌性成虫存在差异的表皮碳氢化合物的绝对含量在不同日龄之间的变化Fig.2 Changes of the absolute content of cuticular hydrocarbons with significant difference in different ages of Octodonta nipae female adults

2.3 不同性别的水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物含量的差异

虽然性成熟的水椰八角铁甲雌雄成虫之间表皮正二十二烷(t8=-2.259，P>0.05)、正二十三烷(t8=-2.649，P>0.05)、正二十五烷(t8=-1.041，P>0.05)、正二十七烷(t8=-0.411，P>0.05)、正二十八烷(t8=-0.758，P>0.05)、正二十九烷(t8=-1.218，P>0.05)、正三十烷(t8=-2.007，P>0.05)、2,6,10,15-四甲基二十一烷(t8=-1.596，P>0.05)、反式-10-二十一烯(t8=-0.847，P>0.05)、5-甲基-5-顺式-二十二烯(t8=-1.911，P>0.05)、环二十四烷(t8=-1.105，P>0.05)、环十八烷(t8=-1.034，P>0.05)和环三十烷(t8=-1.920，P>0.05)的含量不存在显著差异，但是正二十烷(t8=-3.608，P<0.05)、正二十一烷(t8=-4.996，P<0.05)、正二十四烷(t8=-6.418，P<0.01)、正二十六烷(t8=-4.113，P<0.05)、2-甲基十九烷(t8=-3.130，P<0.05)、10-甲基二十烷(t8=-2.660，P<0.05)、1-二十烯(t8=-8.152，P<0.01)和1-二十二烯(t8=-4.745，P<0.05)等8种化合物的含量皆差异显著(图3)。与性成熟的雌虫相比，性成熟的雄虫表皮正二十烷、正二十一烷、正二十四烷、正二十六烷、2-甲基十九烷、10-甲基二十烷、1-二十烯和1-二十二烯的平均绝对含量分别显著升高1.31、2.62、10.50、2.97、1.35、1.35、5.66和4.32倍。这些结果表明，水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的含量具有性别二态性。

图3 性成熟的水椰八角铁甲雌雄成虫的表皮碳氢化合物的绝对含量Fig.3 Absolute content of cuticular hydrocarbons in mature male and female of Octodonta nipae adults注：图中数据为平均值±标准误。星号表示雌雄成虫之间差异显著(*，P<0.05；**，P<0.01)。Note: Data are shown as mean±standard error (SE). Asterisks indicate significant difference between male and female (*, P<0.05; **, P<0.01).

3 结论与讨论

据前人报道，不仅黑腹果蝇Drosophilamelanogaster表皮7-二十三烯等直链烯烃(Scott, 1986)、刺舌蝇Glossinamorsitans表皮19,23-二甲基-1-三十三烯等甲基烯烃(Carlson and Schlein, 1991)、隐翅虫Aleocharacurtula表皮15,19-二甲基三十七烷等甲基烷烃及顺式-9-二十一烯等直链烯烃(Peschke and Metzler, 1987)和意大利蜜蜂Apismellifera表皮正十六烷等直链烷烃(Breed and Stiller, 1992)等多种碳氢化合物的含量均在雌性和雄性之间存在显著差异，而且昆虫也可以通过调控这些特异性表皮碳氢化合物的合成影响个体的交配行为，从而有利于个体的种群识别和配偶选择(Peschke, 1987)。而本文研究结果表明，虽然日龄、性别和性成熟与否等昆虫个体因素对水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的种类没有影响，但是会影响正二十烷、正二十一烷、正二十三烷、正二十四烷、正二十六烷、正二十八烷、正三十烷、2-甲基十九烷、10-甲基二十烷、2,6,10,15-四甲基二十一烷、1-二十烯、反式-10-二十一烯、1-二十二烯和5-甲基-5-顺式-二十二烯等多种化合物的含量。因此，不同日龄的水椰八角铁甲成虫表皮碳氢化合物的动态变化及性别差异可以为该虫个体的种内识别和配偶选择提供化学信号和线索。然而这些绝对含量和相对含量发生显著改变的表皮碳氢化合物的种类是否是诱导水椰八角铁甲性成熟个体产生性选择行为的关键因子目前还不清楚，有待进一步证实。由于日龄和性别等个体因素引起该虫的表皮碳氢化合物的差异主要体现在物质的含量上，而种类稳定，说明个体因素不影响利用表皮碳氢化合物进行近缘种的识别，可以提取种内共有物质作为种的特征峰，同时它们可以作为标记性化合物，通过建立不同个体条件下水椰八角铁甲的指纹图谱，为在检验检疫监测与防控工作中快速鉴定该虫的日龄、性别及其性成熟状态提供数据支持，从而明确该虫的发生情况。

昆虫刚羽化时为成虫表皮碳氢化合物的合成初期，此时这些化合物的碳链长度偏短且以结构简单的烷烃为主，而羽化后24 h才进入主要合成期(Lockey, 1988)。随着昆虫的生长发育，表皮碳氢化合物会经过一系列脱羧反应从而延长碳链，并且在去饱和酶的作用下迅速增加不饱和烃类的含量(Flaven-Pouchonetal., 2016)。由本研究可知，水椰八角铁甲雄性成虫各类表皮碳氢化合物的含量基本与这一合成规律相吻合，但是雌性成虫表皮碳氢化合物在不同日龄间的动态变化似乎比雄性更为复杂，据此猜测雌性成虫对于表皮碳氢化合物具有更加精细的合成调控机制，这可能在雌性的配偶选择或生殖过程中发挥重要作用。同时，Weddle等(2012)发现，短翅灶蟋Gryllodessigillatus表皮碳氢化合物的种类和含量存在明显的性别二态性，这与本文在水椰八角铁甲上的研究结果相一致。此外，环境因素和遗传因素都可能影响到雌雄成虫表皮碳氢化合物的种类和含量(Weddleetal., 2012)。所以，水椰八角铁甲雌雄成虫表皮碳氢化合物含量及其差异是否是环境因素和遗传因素共同作用的结果有待进一步确定，它们对表皮碳氢化合物合成的影响权重也有待进一步研究。然而，雌雄两性表皮碳氢化合物的表观遗传差异所引起的行为偏好可以作为未来研究的热点，这可以为水椰八角铁甲的交配策略提供科学依据。