苯甲酸阿格列汀中未知杂质的分离与鉴定

2020-09-14张贻伦赵心怡董淑波沈文斌董海娟

中国药科大学学报 2020年4期

张贻伦，赵心怡，董淑波，董超，沈文斌*，董海娟**

（1中国药科大学药物科学研究院，南京210009；2江苏德源药业股份有限公司，连云港222000）

苯甲酸阿格列汀（alogliptin benzoate，AB），化学名为（R）-2-｛［6-（3-氨基哌啶-1-基）-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苄氰苯甲酸盐（图1），是日本武田制药研发的一种治疗2 型糖尿病的新药，2010 年4 月在日本省首次获准上市，商品名为Nesina，2013 年1 月美国FDA 批准阿格列汀上市，2013 年7 月我国CFDA 批准进口阿格列汀上市，商品名尼欣那。苯甲酸阿格列汀是一种高度选择性的丝氨酸蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ（DPP-IV）抑制剂，能够抑制胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）的分解，促进胰岛素的分泌，从而发挥降糖作用，用于2型糖尿病患者血糖的控制。临床研究表明，患者对该药的耐受性良好，不良反应轻微［1～5］。目前，苯甲酸阿格列汀在各国药典中均尚未收录，对于苯甲酸阿格列汀的杂质研究相对较少，且侧重于药物的各种降解杂质的研究［6-10］。

Figure 1 Structure of alogliptin benzoate

本研究从苯甲酸阿格列汀大生产合成过程中分离纯化制备得到了苯甲酸阿格列汀的4 种有关物质，根据其合成工艺和结构特点，经过核磁共振、高分辨质谱、红外光谱等多种光谱鉴定方法，确认了这4 种化合物的结构（图2），这4 种有关物质尚无文献报道，属于新发现的杂质。本研究中分离出苯甲酸阿格列汀生产工艺中产生的有关物质、确证其结构、积累充分的数据，对产品质量控制具有重要意义，同时也可为确定合理的关键工艺步骤及参数范围提供参考依据。

Figure 2 Impurities structures of alogliptin benzoate

1 材料

1.1 药品与试剂

KBr（光谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；柱色谱硅胶（青岛美高集团有限公司）；薄层色谱硅胶板（GF254 薄板，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司），其他试剂均为市售分析纯，水为纯净水；（R）-3-氨基哌啶二盐酸盐（工业级，成都美域高制药有限公司）；3-甲基-6-氯尿嘧啶（95%，药明康德新药开发有限公司）。

1.2 仪器

1260-6230 TOF LC-MS 质谱仪（美国安捷伦公司）；UV-2550 PC 紫外光谱仪（日本岛津公司）；TENSOR 27 型红外光谱仪、AV-500 型核磁共振仪（德国布鲁克公司）；QuikSep-PO300DII制备高效液相色谱仪（北京惠德易科技责任有限公司）；SP ODS-A 制备柱（50 mm × 250 mm，5 µm，北京惠德易科技责任有限公司）。

2 方法

2.1 苯甲酸阿格列汀的合成方法

本研究采用参考文献［11］的方法，对合成条件及溶剂进行优化，以3-甲基-6-氯尿嘧啶为原料和2-氰基溴苄反应得2-｛［6-氯-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈（中间体1），再与（R）-3-氨基哌啶二盐酸盐经亲核取代反应得（R）-2-｛［6-（3-氨基哌啶-1-基）-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈（中间体2），最后与苯甲酸成盐得到苯甲酸阿格列汀，避免了氨基保护、脱保护的繁琐步骤，改进后的工艺反应步骤少、条件温和、操作简单，更适合于工业化生产。

2.2 苯甲酸阿格列汀杂质的分离制备

杂质L 的制备：产生于生产工艺第1 步中，存在于中间体1 及其母液中，可以传递至第2 步反应中。杂质L 主要是通过对第2 步二氯甲烷废液进行柱色谱分离得到。

收集中间体2制备过程中的二氯甲烷废液，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，析出固体，直至剩余母液体积约0.5 L，过滤分出滤饼，剩余母液采用湿法上柱，玻璃色谱柱直径3.3 cm，装柱高度约40 cm。先用二氯甲烷洗脱，至未吸附组分被完全冲出（此部分不收集），再用二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脱，收集Rf在0.4～0.9之间的一系列组分的混合液，减压浓缩，至二氯甲烷基本蒸出，体系为深棕色甲醇和杂质的悬浊液，过滤分离母液和滤饼。将收集的母液用湿法上柱，正己烷-乙酸乙酯（5∶1→1∶1）冲柱，收集Rf在0.6～0.8 之间的组分，合并，减压浓缩至干，然后用干法制沙，上柱，正己烷-乙酸乙酯（15∶1→1∶1）冲柱，收集Rf为0.8 的组分，减压浓缩至干后即得杂质L。

Figure 3 Synthetic route of alogliptin benzoate

杂质M 的制备：产生于生产工艺第1 步中，其制备过程基本与杂质L相同，在获得深棕色甲醇和杂质的悬浊液后过滤分离母液和滤饼。母液用于制备杂质L，而滤饼用于制备杂质M。滤饼烘干，取5.0 g，用二氯甲烷100 mL 加热溶解，加入硅胶25 g，减压浓缩制沙。玻璃色谱柱直径约4 cm，使用120 g 硅胶装柱，上样后用二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶1→10∶1）冲柱，收集Rf为0.8的洗脱液。将洗脱液减压浓缩至干，加入乙酸乙酯30 mL，回流打浆0.5 h，室温搅拌2 h，过滤。将滤饼置于50 ℃鼓风干燥箱干燥过夜，即得到杂质M。

杂质T 的制备：产生于生产工艺第2 步中，为中间体2 相关杂质。取第2 步反应二氯甲烷废液，减压浓缩至干，用残留物3倍质量的硅胶和适量二氯甲烷制沙，装柱，用乙酸乙酯-二氯甲烷-正己烷（1∶1∶7→1∶1∶2）洗脱，收集含有47.2 min 组分的洗脱液，减压浓缩。将收集的浓缩物用甲醇溶解，配制成20 mg/mL的溶液，进样量3 mL，用制备液相进行分离。柱温30℃，以乙腈-水（60∶40），流速40 mL/min，检测波长278 nm，收集主成分（17～19 min），减压浓缩至干，即得杂质T。

杂质V 的制备：产生于生产工艺第1 步中，是从中间体1 的甲苯母液中分离获得。取第1 步反应的甲苯母液2 L，用2 mol/L 盐酸洗涤至洗涤液呈酸性，然后将甲苯层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干，加入残留物质量3 倍的硅胶和适量二氯甲烷，加热搅拌使残留物溶解并吸附至硅胶上，然后减压浓缩除去二氯甲烷，得到负载上样品的硅胶，然后上柱。用二氯甲烷-乙酸乙酯（30∶1→10∶1）洗脱，收集中间体1 检测方法下保留时间9.9 min 的洗脱液。将洗脱液减压浓缩至干，即得杂质V。

3 结果与讨论

3.1 杂质L的结构鉴定

白色粉末状固体，由其高分辨质谱图得到准分子离子峰m/z：330.099 44［M+H］+（计算值：330.100 38），化合物1 的分子量为奇数，分子中应含奇数个N 原子，同时由m/z332 的峰强度约为m/z330 峰强度的1/3，可以推断出杂质L 含有一个氯原子，推断其分子式为C17H16ClN3O2，不饱和度为11。在UV 光谱中，最大吸收峰λmax在293.6 nm，227.2 nm 处，说明结构中含有共轭体系。在IR 光谱中，显示出了羰基（1 712 cm-1），芳腈基（2 229 cm-1），碳碳双键（1 658，1 635 cm-1），苯环骨架且为1，2-取代苯（1 602，1 572，1 487 cm-1），以及嘧啶环呼吸振动（1 009 cm-1）的特征吸收峰。

1H NMR（表1）谱中，给出10 组峰，在低场区δH8～7 的4 个质子δ7.88（1H，d）、7.68（1H，t）、7.50（1H，t）和7.42（1H，d）为一个自旋体系，为邻-二取代苯上的4个芳质子，即2-氰基溴苄中的芳环质子。COSY 谱表明δ6.87（1H，m）、6.16（1H，d）、2.18（2H，m）和1.01（3H，t）它们为一个自旋体系，为片段CH3CH2CH==CH--上的7 个质子；δ5.46（2H，s）和3.24（3H，s）是2组孤立信号，δH5.46（s，2H）是2个质子，判断其为2-甲基-苄氰单元中的仲碳质子；δH3.26（s，3H）是3 个质子，可判断其为起始原料3-甲基-6氯尿嘧啶中的孤立甲基单元。

13C NMR（表1）和DEPT 谱提示化合物1 的结构中，含有17 个C，其中包含2 个伯碳、2 个仲碳、6个不饱和叔碳和7个不饱和季碳。δC28.4，13.4为两个甲基碳，δC48.5，26.5 为2 个亚甲基碳；δC138.2、133.7、133.2、128.2、126.6 和119.4 为6 个不饱和叔C；δC159.8、149.8、141.3、139.7、116.8、109.5 和108.8 为7 个不饱和季碳。δC159.8 和149.8 的2 个季C 为羰基碳，HMBC 谱中，H-10（δH3.24）与C-11（δC159.8）和C-9（δC149.8）相关，H-14（δH6.16）与C-11（δC159.8）相关，δC159.8 的季碳为C-11；H-14（δH6.16）和H-15（δH6.87）与C-12（δC108.8）相关，故C-12 上连接--CH==CHCH2CH3基团；δC116.8 和109.5 的2 个季碳分别为-CN 及与-CN 相连的季碳，δC109.5的季碳与H-8（δH5.46）远程相关，为C-1，则δC116.8 为C-7；δC141.3 和139.7 的两个季碳分别与H-14（δH6.16）和H-6（δH7.88）远程相关，因此它们分别为C-13 和C-2。该杂质比中间体1（图3）多出1 个丁烯基，可能是合成第一步反应所得中间体1 与三正丁胺反应得到的产物，确定该杂质为（E）-2-｛［5-（1-丁烯-1-基）-3-甲基-6-氯-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈。

Table 1 1H NMR and 13C NMR(500/500 MHz)data of Impurities of alogliptin benzoate

3.2 杂质M的结构鉴定

类白色粉末状固体，由其高分辨质谱图得到准分子离子峰m/z：391.095 27［M+H］+（计算值：391.095 63），杂质M 的分子量为偶数，分子中应含偶数个N 原子，同时由m/z393 的峰强度约为m/z391 峰强度的1/3，杂质M 中含有一个氯原子，推断其分子式为C21H15ClN4O2，不饱和度为16。在UV光谱中，最大吸收峰λmax在275.6 nm，225.2 nm处，说明杂质M 的结构中含有共轭体系。在IR 光谱中，显示出羰基（1 707 cm-1），腈基（2 225 cm-1），嘧啶环伸缩振动（1 647，1 622 cm-1），苯环骨架碳碳双键（1 622，1 601，1 487 cm-1）和环呼吸振动（980 cm-1）的特征吸收峰。

由杂质M 的1H NMR、13C NMR（表1）可知，δH3.24（3H，s）及δC28.5、δC150.6、δC160.9等表明杂质M 中存在3，4-二氢-3-甲基-2，4-二氧代-1（2H）-嘧啶片段；COSY 谱表明δ7.89（1H，d）、7.71（1H，t）、7.52（1H，t）和7.49（1H，d）这4个芳质子为一个自旋体系，δ7.80（1H，d）、δ7.61（1H，t）、δ7.42（1H，t）和δ7.39（1H，d）这4 个芳质子为一个自旋体系，δH5.47（2H，s）和δH4.02（2H，s）表明杂质M中存在两个邻氰基苄基片段。杂质M 与中间体1相比，少了1 个烯质子、多了1 个邻氰基苄基片段，说明12位烯质子被邻氰基苄基所取代。这个结果与高分辨质谱得到的结果相吻合，即与中间体1相比，增加了8 个碳原子、5 个氢原子和1 个氮原子。所以确定了杂质M 为2-｛［5-（2-氰基苄基）-3-甲基-6-氯-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈。该杂质可能是生产工艺第一步中1 分子3-甲基-6 氯尿嘧啶与2 分子2-氰基溴苄反应得到的中间产物。

3.3 杂质T的结构鉴定

类白色絮状固体，由其高分辨质谱图得到其［M+Na］+峰m/z：423.142 61［M+Na］+（计算值：423.142 76），杂质T 的分子量为偶数，分子中应含偶数个N原子，推断其分子式为C23H20N4O3，不饱和度为16。

1H NMR（表1）谱可以看出其比杂质M 多出一个自旋体系，δ4.01（2H，q）和1.15（3H，t）为乙氧基（--OCH2CH3）上的5 个质子，这正好与其分子式比化合物2 的分子式多出C2H5O 相吻合。在杂质T的13C NMR（表1），HMBC 谱中，δC158.6 的季碳与H-22（δH4.01）、H-14（δH3.89）、H-8（δH5.24）均远程相关，即为C-13；δC143.4、111.3 和97.0 的3 个季碳均与H-14（δH3.89）远程相关，但其中只有δC97.0 的C 不与苯环上的质子远程相关，为C-12；由于连接基团的改变，杂质T 中C-12、C-13 的化学位移改变较大，因此确定了杂质T为2-｛［6-乙氧基-5-（2-氰基苄基）-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈。杂质T是在合成反应的第2步由杂质M与乙醇反应转化而来。

3.4 杂质V的结构鉴定

类白色粉末状固体，由其高分辨质谱图得到准分子离子峰m/z：353.964 40［M+H］+（计算值：353.963 94），同时由m/z356的峰强度约为m/z354峰强度的4/3，可以推断出杂质V 中含有1 个氯原子和1 个溴原子，其分子式为C13H9BrClN3O2，不饱和度为10。那么杂质V 的分子式比中间体1 多1个Br 原子，少1 个H 原子，与杂质L 的分子式相比少了C4H7片段，多1个Br原子。

1H NMR（表1）谱中，其与杂质L相比少一个自旋体系，即片段CH3CH2CH==CH--上的7个质子，这正好与其分子式比杂质L 的分子式少了C4H7相吻合。13C NMR（表1）谱，HSQC、HMBC 相关谱中，δC157.7 和150.1 的2 个季碳为羰基碳，它们来自于原料3-甲基-6 氯尿嘧啶结构单元；H-8（δH5.46）与C-13（δC144.4）、C-2（δC139.2）和C-1（δC109.5）的3 个季C 远程相关，C-2（δC139.2）还与H-6（δH7.89）远程相关；C-7（δC116.9）也与H-6（δH7.89）远程相关，δC98.2 则为C-12，Br 原子与12 位碳相连，Br 原子取代了12 位的烯质子。所以确定杂质V为2-｛［5-溴-6-氯-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈。该杂质由中间体1 的母液中分离制得，可能是中间体1与起始物料2-氰基溴苄降解后产生的Br2反应而来。