盐酸利多卡因注射剂遗传毒性杂质研究

冼芷然，孙春萌，骆雪芳*，钟文英**

（1中国药科大学理学院药物质量研究中心，南京211198；2中国药科大学药学院，南京211198）

盐酸利多卡因（lidocaine hydrochloride）为临床上常制成盐酸利多卡因注射剂应用于局部麻醉药［1］和抗心律失常药物等［2-3］。作为国内一致性评价药物目录的基本药物，原料及制剂的系统杂质研究尚无文献报道，对制剂中高风险杂质进行系统研究十分必要。

在小分子化学药物一致性评价中，遗传毒性杂质因其毒性危害大，在极微量水平即能与体内DNA 分子反应诱发DNA 突变或致癌，是药物安全性评价的重要内容。遗传毒性杂质在药物制剂中主要来源于原料工艺及原辅料降解，本文根据盐酸利多卡因的结构及合成工艺，结合相关文献及研究资料确定了2，6-二甲基苯胺为遗传毒性杂质，N-氯乙酰-2，6-二甲基苯胺为潜在遗传毒性杂质。已有测定盐酸利多卡因中杂质2，6-二甲基苯胺的文献报道［3-4］，现有药品标准中《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）（2015）［5］收录的盐酸利多卡因注射液中杂质2，6-二甲基苯胺质控限度为0.04%，《中国药典》（2015）、欧洲药典9.0［6］收录盐酸利多卡因原料中杂质2，6-二甲基苯胺质控限度为0.01%，美国药典40［7］对盐酸利多卡因原料中杂质2，6-二甲基苯胺（质控限度：0.01%）与杂质2，6-二甲基苯基乙酰胺（质控限度：0.1%）均进行了控制。暂无文献报道对遗传毒性杂质和潜在遗传毒性杂质同时进行控制。本研究通过建立LC-MS/MS 方法，检测2，6-二甲基苯胺和潜在遗传毒性杂质N-氯乙酰-2，6-二甲基苯胺在原料、自制制剂及原研制剂中的检出数量及含量，并通过强制降解试验确定遗传毒性杂质的来源和降解途径，评估降解风险，为该制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

EX125DZH 电子天平（美国奥豪斯公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪配紫外检测器、柱温箱及自动进样器（美国安捷伦公司）；AB API3000 单四极杆质谱检测器，配有电喷雾电离源（美国应用生物系统公司）；MILLIPAK Millipore 超纯水仪（德国默克公司）。

1.2 试 药

甲醇（色谱纯，德国默克公司）；水（超纯水，德国默克超纯水仪自制）。盐酸利多卡因原料药（山西新宝源制药有限公司，批号：201811009、201811012、201811016）；盐酸利多卡因注射液自制制剂（实验室自制，批号：190502、190503，规格：100 mg：5 mL，原料批号201811009）；盐酸利多卡因注射液参比制剂（德国费森尤斯集团，批号：6120311，规格：100 mg：5 mL）。N-氯乙酰-2，6-二甲基苯胺（欧洲药典，批号：1366080，纯度99%）；2，6-二甲基苯胺（英国政府化学家实验室，批号：108951，纯度99.8%）、2，6-二甲基苯基乙酰胺（批号：154427，纯度99.98%）、N-2，6-二甲基苯基-2-乙基氨基乙酰胺（批号：142855，纯度99.5%）、杂质2-二乙基叠氮酰基-N-2，6-二甲基苯基乙酰胺（批号：833116，纯度98.4%）（英国政府化学家实验室）。

2 方 法

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 检测色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm × 250 mm，5 µm），流动相为甲醇-水（80∶20）等度洗脱，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样体积20µL。

2.1.2 检测质谱条件 正离子模式；采集模式：MRM；雾化器指数：8；气帘：8；碰撞气：4；离子源压力：5 000 psi；离子源温度：400 ℃。质谱参数见表1。

2.1.3 强制降解试验色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm × 250 mm，5 µm），流动相A：4.85 g/L 磷酸二氢钾（氢氧化钠调节pH 至8.00），流动相B：乙腈，流动相梯度：25%B→60%B；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长：230 nm；进样体积20µL。

Table 1 Mass spectrometer of genotoxic impurities.

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别取杂质A与杂质B对照品适量，以甲醇-水（80∶20）的混合溶液溶解并定量稀释制成含杂质各100 ng/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 原料药供试品溶液 取盐酸利多卡因原料药约25 mg，置25 mL 量瓶中，加甲醇-水（80∶20）的混合溶液，振摇使溶解，定容并摇匀即得。

2.2.3 制剂供试品溶液 另取自制制剂与参比制剂各适量（约相当于盐酸利多卡因50 mg），置50 mL 量瓶中，加甲醇-水（80∶20）的混合溶液，定容并摇匀即得。

2.2.4 强制降解试验供试品溶液 取盐酸利多卡因原料药各约50 mg，置于10 mL量瓶中，分别加入1 mol/L HCl溶液2 mL、1 mol/L NaOH 溶液2 mL、1%双氧水2 mL，于常温避光环境下各放置24 h 进行酸、碱、氧化强制降解，另取各约10 mg，置于10 mL 量瓶中，加入超纯水2 mL 振摇使溶解，于60 ℃烘箱、5 000 Lx 的光照试验箱下放置24 h 进行高温与光照强制降解。上述强制降解溶液破坏结束后加流动相A-流动相B（70∶30）的混合溶液定容并摇匀即得。另取盐酸利多卡因原料药约50 mg，置于10 mL 量瓶中，加入超纯水2 mL 振摇使溶解，于常温避光环境下放置24 h 后加流动相A-流动相B（70∶30）的混合溶液定容并摇匀，得未破坏供试品溶液，精密量取上述溶液适量，加流动相A-流动相B（70∶30）的混合溶液定量稀释，配制0.1%的自身对照溶液。

3 结果与讨论

3.1 遗传毒性杂质与潜在遗传毒性杂质的筛选

据文献［8-10］报道，利多卡因主要由两条合成路线制备，其中最常用合成路线见图1［8］，根据该合成路线推测降解杂质可能含起始物料2，6-二甲基苯胺（图2-A）、中间体N-氯乙酰-2，6-二甲基苯胺（图2-B）及二乙氨键断裂后降解产物N-2，6-二甲基苯基乙酰胺（图2-C）；Li 等［11］指出叔胺易氧化形成N-氧化物，故含叔胺结构的利多卡因易氧化降解形成2-二乙基叠氮酰基-N-2，6-二甲基苯基乙酰胺（图2-D）；Li 等［12］指出，利多卡因一步代谢可形成代谢产物2，6-二甲基苯胺与N-2，6-二甲基苯基-2-乙基氨基乙酰胺（图2）。

针对以上文献信息，本研究从5个降解杂质中筛选出一个遗传毒性杂质与一个潜在遗传毒性杂质，详细说明如下。

Figure 1 Synthesis route of lidocaine

Figure 2 Structures of possible degradation products in lidocaine hydrochloride

3.1.1 2,6-二甲基苯胺（下文简称杂质A） 杂质A为合成盐酸利多卡因的关键起始物料，其主要致突变/致癌基团为芳香胺，芳香胺易形成亲电氮离子与DNA 反应产生基因突变和/或致癌。Kobets等［13］提出，大鼠慢性生物试验中表明杂质A 会增加腺瘤和鼻腔癌的发生率，致癌性及体内遗传毒性均显示阳性。Koujitani 等［14］的毒性研究数据表明，连续52 周对大鼠的饮食中施以3 000 mg/kg 的杂质A 后，组织病理学评估结果显示该组的肿瘤发生率为33%，即TD50（median toxic dose，半数中毒剂量）大于3 000 mg/kg，根据ICH M7 指导原则［15］按照TD50进行线性外推计算限度的方法，代入该值计算该杂质的限度为1%。而在已有药品标准中，《中国药典》（2015）［5］规定杂质2，6-二甲基苯胺在盐酸利多卡因注射液中的限度为0.04%，在盐酸利多卡因原料药中的限度为0.01%，欧洲药典9.0［6］、美国药典40［7］均规定盐酸利多卡因原料药中2，6-二甲基苯胺的限度为0.01%，在各国药品标准对该杂质的质控要求更权威及更严格的背景下，本研究按照从严控制原则，选择各药典中规定的最低限度0.01%对盐酸利多卡因注射液中该杂质进行控制。

3.1.2N-氯乙酰-2,6-二甲基苯胺（下文简称杂质B） 杂质B 结构中含脂肪族氯代基团，电负性的氯使其邻位的α-C易失电子形成亲电基团，该亲电基团易与DNA 等亲核物质发生反应，产生基因突变［16］。该杂质目前无确切致癌性及致突变性数据，本研究参考文献［17］中卤代物典型化合物的致癌性及致突变性试验数据中化学结构较相近的化合物4'-氯乙酰基乙酰苯胺的毒性数据来评估杂质B 的遗传毒性风险。文献表明该化合物无致癌性TD50数据，但存在致突变性（AMES 试验阳性），即无致癌性、有致突变性。根据ICH M7 指导原则［14］中的分类标准，可将杂质B 列为2类遗传毒性杂质，需将其控制在合适的毒理学阈值（threshold of toxicological concern，TTC）以下。按照指导原则中相关说明，用于麻醉的药品，其药物治疗时长不超过1 个月，遗传毒性杂质的可接受摄入量为120µg/d，结合盐酸利多卡因注射液最大日剂量0.3 g计算，杂质限度为PDE/最大日剂量即0.04%。因杂质B与杂质A同为利多卡因的可能降解产物，且其潜在遗传毒性未能准确评估，为更严格地控制杂质水平，将该杂质限度与遗传毒性的杂质A 限度保持一致，即按0.01%控制。

3.1.3N-2,6-二甲基苯基乙酰胺（下文简称杂质C） 本研究暂未查到杂质C 相关毒性资料，根据ICH 的指导原则，在缺乏安全性数据的支持下，可采用“警示结构”［18］对杂质进行遗传毒性筛选并进行分类。经比对，发现杂质C 中含有警示结构“芳胺的酰化物”，该结构在盐酸利多卡因原料药中亦存在。由于杂质C与原料药具有相同的警示结构，按照ICH M7 的分类原则，应对其按4 类杂质进行控制，即按非致突变杂质进行控制。

3.1.4N-2,6-二甲基苯基-2-乙基氨基乙酰胺（下文简称杂质D） 杂质D 为盐酸利多卡因叔胺上N原子的氧化产物，目前暂未查到文献报道有关该杂质的遗传毒性数据，在ICH M7 指导原则参考的警示结构列表中，无烷基叔胺氮氧化物结构，即表明在大量毒性试验中暂无证明此基团存在潜在遗传毒性的数据。综上所述，因杂质D 不含警示结构，按遗传毒性分类原则将其分为5 类杂质，不将其按照潜在遗传毒性杂质进行研究。

3.1.5 2-二乙基叠氮酰基-N-2,6-二甲基苯基乙酰胺（下文简称杂质E） 与杂质D 同理，对于暂无文献报告杂质E的遗传毒性数据，本研究通过与指导原则中的“警示结构”［18］比对来预测该杂质的遗传毒性，比对结果显示，杂质E 亦无可匹配的警示结构，按遗传毒性杂质分类原则将其分为5 类杂质，亦不列入潜在遗传毒性杂质范围。

综合以上分析，本研究最终确定盐酸利多卡因中遗传毒性杂质为2，6-二甲基苯胺，潜在遗传毒性杂质为N-氯乙酰-2，6-二甲基苯胺，二者在盐酸利多卡因原料药及注射液中检出均不得过0.01%。

3.2 遗传毒性杂质与潜在遗传毒性杂质的检测

现行各国药典规定的盐酸利多卡因原料及注射液中2，6-二甲基苯胺检查法所采用的流动相中均含磷酸盐［5-7］，不适用于质谱联用检测。本研究在建立遗传毒性杂质检测方法过程中，将流动相中水相改为超纯水，有机相改为在质谱中较乙腈更易离子化的甲醇，流动相流速降为0.3 mL/min，通过调整水相与有机相比例使API 与两个待测杂质实现良好分离。在优化的色谱条件下用液质联用仪进行一二级质谱碎片扫描，分别确定各杂质定量离子对并进行质谱参数优化，从而确定液相-质谱联用条件。由于API 在两个待测杂质出峰后经色谱柱洗脱，因此在检测方法中杂质A 与杂质B均出峰后设置通道切换，将后续含高浓度API的流出液作为废液排出，以保护质谱仪。在确定的色谱条件下，空白溶剂（80%甲醇）、混合对照品溶液及供试品溶液杂质测定谱图见图3，从图谱上看，在杂质A 与杂质B 特异性Q1/Q3 定量离子对通道下，各相邻峰均不干扰该峰检测；该色谱及质谱条件下杂质A 与杂质B 的定量限分别为43.91 与40.39 ng/mL，约相当于0.004%的盐酸利多卡因，可满足本品质控限度要求。

Figure 3 Chromatograms of potential genotoxic impurities tests

取各杂质对照品及盐酸利多卡因原料药、自制制剂、原研制剂照“2.1”项下方法配制混合对照品溶液与供试品溶液，按照遗传毒性杂质检测方法进样，以外标法计算各杂质含量，测定结果见表2。

Table 2 Results of content of potential genotoxic impurities of lidocaine hydrochloride API, homemade preparations and reference preparations

表中结果显示，批号201811009的原料药和由该批次制成的自制制剂及批号201811012 的原料药中杂质A 与杂质B 均有检出，批号201811016 原料药仅检出杂质B。与原料及自制制剂相比，原研制剂仅检出少量的杂质A。比对各组数据，两个杂质检出量均呈现自制制剂＞原料药＞原研制剂的趋势。对原料药与原研制剂杂质检出量进行比对分析可知，杂质可能来源于原料生产过程中的工艺杂质，也可能来源于原料储运过程中产生的降解。而由自制制剂与原料药杂质检出量的差异判断，从原料储存―制剂制备―制剂储存的途径中，盐酸利多卡因均存在降解产生杂质A 与杂质B 的趋势。综合以上分析，原料生产工艺与杂质的降解均可能是导致自制制剂与原研制剂遗传毒性杂质检出情况不一致的原因。本研究主要从杂质的降解方面入手，设计原料药的强制降解试验，进一步探究上述杂质的主要降解途径和降解程度，为注射液的制备工艺和储存条件提供参考。

3.3 强制降解试验

照上述“2.2.4”项下配制方法进行酸、碱、氧化、高温及光照强制降解试验，取各溶液于“2.1.3”条件下进样，计算强制降解供试品溶液各杂质含量与未破坏供试品溶液各杂质含量的绝对偏差，为更全面分析盐酸利多卡因降解途径，本研究将“3.1”项下涉及的5个降解杂质均进行了降解含量分析，结果如见表3。

结果显示，碱降解及氧化降解为盐酸利多卡因的主要降解途径，在较极端的酸、高温及光照条件下盐酸利多卡因较稳定。在氧化破坏条件下，主要降解产物为杂质D，其次为杂质E 与杂质A，据之前分析，杂质D 与杂质E 无潜在遗传毒性，对盐酸利多卡因遗传毒性风险影响较低。观察盐酸利多卡因化学结构，其中含有关键基团酰胺键，试验前期笔者初步预测盐酸利多卡因易发生酰胺键的水解反应降解形成杂质A 而使原料药和制剂的遗传毒性风险大大增加，但根据试验结果可以看出，在各条件下杂质A 均没出现较大的降解趋势，该现象的出现可能由于苯环上邻位的两个甲基形成的空间位阻对酰胺键起了一定的保护作用［12］。在碱性条件下仅杂质B 有少量降解。结合上述原料药与自制制剂中杂质的检测结果分析，杂质A与杂质B 在自制制剂的含量与原料药相比有所增加，与强制降解试验二者均有少量降解的结果一致，证明了前述对于杂质A与杂质B除了来源于原料工艺杂质外还会来源于盐酸利多卡因的降解这一推断。

Table 3 Results of the forced degradation tests of lidocaine hydrochloride

综合强制降解试验结果可知，盐酸利多卡因主要在碱性条件和氧化条件下产生降解，形成杂质A 和杂质B，遗传毒性风险增加。针对以上结果，可在本品制备和储存过程中针对含氧量与酸碱度进行条件优化，以减少盐酸利多卡因的降解。本研究对盐酸利多卡因自制制剂储存过程中的氧气接触时间进行了优化，在安瓿瓶熔封前向瓶内灌入高纯氮气，将瓶内注射液与空气隔绝，再进行熔封，制成批号为190503 的小试批自制制剂。照“3.2”项下步骤测定两个待测杂质的含量，杂质A与杂质B 检出量分别为5×10-4%与1.6×10-3%。与批号为190502 的杂质含量检测结果进行比对分析，经过充氮保护后，盐酸利多卡因降解出杂质A的趋势有所下降，说明充氮保护对形成杂质A 的降解途径有一定的抑制作用。而杂质B 的检出量未降低，说明充氮保护不能抑制杂质B的降解。

除充氮保护外，有文献报道曾采用在制剂中添加如盐酸赖氨酸［19］、亚硫酸氢钠［20］等抗氧剂或使用脱气水等手段来抑制注射剂的氧化降解，通过加入不同种类的pH 调节剂并适当调节用量来抑制注射剂的酸降解或碱降解。若要实现上述技术在盐酸利多卡因注射液的制备工艺中的应用，需要多方面考察原辅料相容性、辅料自身的毒性与处方的详细用量等，目前仍有待进一步研究。

4 结 论

本研究确定了盐酸利多卡因中遗传毒性杂质与潜在遗传毒性杂质，经检测原料药、自制制剂及原研制剂中遗传毒性杂质检出情况存在一定的差异，根据强制降解试验结果进一步确定该差异主要来源于原料生产工艺与原料药在氧化及碱性条件下的降解，通过充氮保护可一定程度减少杂质2，6-二甲基苯胺的降解，本研究对盐酸利多卡因注射液的遗传毒性风险评估和处方工艺优化提供了理论参考。