柏木粉挥发物组成及其抑菌性能研究

康俊,刘宇昊,李美萍,李欣欣,尉立刚,张生万*

(1.山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006;2.上海海洋大学 食品学院,上海 201306)

0 引言

柏木(CupressusfunebrisEndl.)是柏木属常绿乔木[1]。柏木树适应性强，在中国分布极广，北起内蒙古、吉林，南至广东及广西北部，人工栽培范围几遍全国，是优良的园林绿化树种[2]。柏木树干通直，木材坚韧致密，心材黄棕色，香气宜人、耐久不腐、不翘不裂，是我国民间传统的优质用材[3]。柏木不仅在用材、园林绿化、生态景观建设中适宜选用，而且还有很高的经济价值[4]。其枝、叶、根、种子可提炼柏木油，树干在提取柏木油后经粉碎可做香料，并出口东南亚等国家[2]。因此，柏木的合理开发、利用具有非常重要的意义。目前，对于柏木挥发性成分分析主要集中于植物生长发育过程中向外释放的低沸点易挥发的小分子化合物，即柏木精气[5-6]和柏木精油[7-8]，而对柏木材易挥发成分分析鲜有报道。对于柏木抑菌性能的研究主要集中于柏木精油[9-12]以及柏木不同极性溶剂提取液[13-14]对常见致病菌抑制的研究，而对柏木粉易挥发成分抑菌性能的研究未见报道。

静态顶空(SHS)-气相色谱-质谱(GC-MS)联用法是将样品置于顶空瓶中，适度加热，平衡一定时间,使其挥发性成分直接进行GC-MS联用分析的一种方法。该法集微量成分富集、分离、结构鉴定为一体,具有快速、高效、灵敏及易于再现样品易挥发性成分等优点[15]。目前,SHS-GC-MS 技术在食品、药品分析和环境检测等方面得到了广泛的应用[16]。但该法用于柏木易挥发组成分析,目前尚少见报道。双皿对扣法是一种适用于挥发物拮抗物质筛选的方法[17]。本工作以柏木粉为研究对象,采用SHS-GC-MS联用法,对柏木粉中易挥发成分进样条件及其GC-MS分离检测、结构鉴定、内标法定量分析等条件进行研究,并采用双皿对扣法对其易挥发成分抑菌性能进行了分析，旨在为香气宜人、耐久不腐的柏木功能成分研究建立有效的分析手段，以期为柏木抑菌有效成分的筛选、木材防腐、植物病原菌防治及柏木粉的综合利用提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

柏木粉由山西吉泰香木有限公司提供;正十二烷(色谱纯),正己烷(分析纯);C7-C40正构烷烃(色谱纯)。尖镰孢黄瓜专化型菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloesporioides)、平菇菌(Pleurotas ostrestus)，由山西省农业科学院现代生物研究中心提供;供试培养基为PDA培养基,参照文献[18]的方法制备。

内标溶液的配制:在准确称量装有1 mL正己烷的5 mL容量瓶中,加入适量内标物正十二烷(0.354 g)准确称量,用正己烷稀释至刻度,再准确称量，配成0.070 8 mg/μL的内标溶液。

7694E顶空自动进样装置、HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、HP-FFAP色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、7890A-5975C气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1 分析条件

GC条件:HP-5MS色谱柱;进样口温度250℃;载气He,流速0.8 mL/min;分流比5∶1。程序升温:初温40℃,保持5 min,以4℃/min的速率升至95℃,保持3 min,以3℃/min的速率升温至120℃,保持10 min,以2℃/min的速率升温至165℃,保持5 min。

MS条件:质谱离子源:EI;电子能量70 eV;离子源230℃;四极杆150℃;质量扫描范围m/z 30～500;扫描模式为全扫描。

顶空自动进样参数:顶空平衡加热30 min,加压1 min,定量圈定量0.1 min,平衡0.1 min,进样0.1 min。

平衡温度128℃,定量环140℃,传输线150℃。

1.2.2 定性和定量方法

准确称取0.9 g柏木粉置于20.0 mL顶空瓶中,加入1 μL内标溶液,迅速用带有橡胶隔垫的瓶盖密封,置于顶空自动进样装置中,按1.2.1节分析条件对其易挥发成分进行测定,定性分析通过对所得总离子流色谱图中各组分进行质谱解析并与NIST 11标准谱库进行对照,保留匹配度大于75%的化合物。按文献方法[19],相同的色谱条件下扫描C7～C40正构烷烃,计算各化合物的相对保留值((Retention Index,RI),并与文献值[20-23]比对加以验证化合物结构。各化合物的含量采用内标法[24]计算。

计算方法如下:

(1)

式中:xi为目标化合物在样品中含量;Ai、As分别为目标化合物和内标物的峰面积;ms、m分别为内标物和被测样品的质量;RF为响应因子,定义RF为1。

1.2.3 SHS进样条件选择方法

单因素条件选择方法:单因素条件实验除样品用量分别确定为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g,平衡温度分别确定为80、90、100、110、120、130、140、150℃,平衡时间分别确定为10、20、30、40、50 min外,其他条件按1.2方法进行。每组实验重复3次。

响应面分析条件优化方法:在单因素试验的基础上,用Design-Expert V8.0.6软件设计三因素三水平Box-Behnken响应面试验,对顶空进样条件进行优化,试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

1.2.4 柏木粉易挥发成分抑菌性能的实验方法

将供试菌在新鲜的PDA培养基上活化后,用直径0.7 cm的打孔器从其菌落边缘打取菌饼,将其接入盛有20 mL PDA培养基的培养皿(直径为9 cm)中心,然后将其盖于底部均匀盛有准确称取0.5 g柏木粉的相同直径的培养皿上,用封口膜密封,作为供试组。以相同方法处理,而不放置柏木粉的试验作为对照组,每组重复3份,之后将供试组、对照组同时置于28℃恒温培养箱。当对照组菌丝长满整个培养基平板时停止试验,采用十字交叉法测定供试菌菌落直径,并分别计算供试组、对照组菌落面积。将重复3份的菌落面积平均值作为该组菌落面积,用式(2)计算柏木粉的抑菌率。

抑菌率(%)=

(2)

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件的选择

以所得色谱峰数、总峰面积和分离度为指标,对影响色谱分离的色谱柱、分流比、载气流速等主要因素进行选择。在其他实验条件不变的情况下,分别在弱极性HP-5MS色谱柱和强极性HP-FFAP色谱柱上进行测定,结果表明:HP-5MS色谱柱所得峰个数、总峰面积和分离度均优于HP-FFAP色谱柱。这一结果印证了柏木挥发性成分主要以萜烯类物质为主的事实。根据相似相溶的原则,选择了极性弱、耐高温的HP-5MS色谱柱,并对其程序升温条件进行了认真考察,选定了初温40℃,保持5 min,以4℃/min的速率升至95℃,保持3 min,以3℃/min的速率升温至120℃,保持10 min,以2℃/min的速率升温至165℃,保持5 min的程序升温条件。分流比的选择是以分流比为3∶1,5∶1,10∶1时分别进行实验,结果表明:随着分流比增加,色谱峰的分离度提高,但也会导致灵敏度降低[25],为保证较好的分离度且尽可能多地检出物质,故选择分流比为5∶1。载气流速的选择是以载气流速为1.0、0.8、0.6 mL/min时分别进行实验,结果表明:载气流速为1.0 mL/min时,色谱峰之间存在堆叠现象,载气流速为0.6 mL/min时,色谱峰形变差,存在拖尾现象,载气流速为0.8 mL/min时,色谱峰分离度和对称性均较理想,因此选用载气流速0.8 mL/min。

2.2 SHS进样条件选择

2.2.1 SHS平衡时间的选择

按实验方法对SHS平衡时间进行了选择,其结果如图1所示。

图1 平衡时间对挥发性物质的影响Fig.1 Effect of equilibration time on the volatile compounds

由图1可知,平衡时间在10 min到30 min前,随着平衡时间增加,峰个数和总峰面积逐渐增加；平衡时间为30 min时,总峰面积最大。平衡时间到40 min时峰个数变化不明显,但总峰面积有所下降,可能是体系达平衡后继续延长平衡时间造成部分物质挥发。因此平衡时间选择30 min。

2.2.2 SHS样品用量的选择

按实验方法对SHS样品用量进行了选择,其结果如图2所示。

图2 样品用量对挥发性物质的影响Fig.2 Effect of injected sample amount on the volatile compounds

由图2可知,样品用量为0.1 g和0.7 g时,随着样品用量的增加,色谱峰个数及总峰面积明显增加。当样品用量增至0.9 g时,色谱峰个数增加较缓慢,但继续增加样品用量会造成色谱柱过载,色谱峰分离度、峰形变差,同时也受到顶空瓶体积的限制。综合考虑,样品用量选0.7 g。

2.2.3 SHS平衡温度的选择

按实验方法对SHS平衡温度进行了选择,其结果如图3所示。

图3 平衡温度对挥发性物质的影响Fig.3 Effect of equilibration temperature on the volatile compounds

如图3所示,随着平衡温度从80℃升到120℃,挥发性物质的分子热运动加强,使其更容易扩散,从固体粉末中挥发出来,因此峰个数与总峰面积逐步增加。继续升温至130℃,总峰面积上升,峰个数变化不大,而当温度上升到140℃以上峰个数与总峰面积大幅增加,可能是当温度高时部分物质分解所致,为防止高温分解对结果的影响,平衡温度选120℃。

2.2.4 响应面分析优化条件

在单因素试验基础上,综合考虑以平衡温度、样品用量和平衡时间为自变量,峰个数为响应值Y,按响应面分析条件优化方法,对进样条件进行优化,其试验内容及结果见表2。

方差分析结果见表3,并对响应值与各个因素进行回归拟合,其拟合方程为式(3):

Y=84.6+12.13A+4.25B+

0.63C+0.25AB-0.5AC-

0.25BC-7.3A2-1.55B2-0.8C2。

(3)

由表3的方差分析可知:模型极显著(P<0.01),失拟项不显著(P=0.211 4>0.05),相关系数R2=0.990 9,调整系数RAdj2=0.979 2,说明方程对试验拟合较好,该模型可用于优化SHS进样条件。回归方程各项方差分析表明:各因素对响应值的影响大到小依次为X1平衡温度>X2样品用量>X3平衡时间。因素X1、X2、X12对响应值有极其显著的影响(P<0.01),各因素间的交互作用影响不显著(P>0.05),各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。响应面图见图4，显示了平衡温度、平衡时间和样品用量中任意两个变量取零水平时,其余两个变量对分离得到的色谱峰个数的影响。

表3 回归方程方差分析

图4 任意两变量对峰个数影响的响应曲面图Fig.4 Response surface plots for the effects of any two variables on number of chromatographic peaks

通过回归模型的预测,得到顶空直接进样的最优条件为:平衡温度128.49℃,样品用量0.90 g,平衡时间29.68 min。考虑到操作可行性,将各因素进行调整为:平衡温度128℃,样品用量0.9 g,平衡时间30 min,在此条件下进行3次平行验证试验,分离得到91个色谱峰,与理论预测值92.545 3基本吻合。

2.3 柏木粉易挥发成分分析结果

按实验方法测定柏木粉易挥发成分,其总离子流色谱图如图5所示,解析结果见表4。

由图5和表4结果可知,经气质联用分析,共分离得到91种化合物,其中有60种化合物确定结构,占柏木粉易挥发成分总含量的96.018%。其中烯类化合物33种,占总含量的67.282%,烯类化合物中萜烯类化合物22种,占总含量的60.996%。研究表明,萜类化合物,包括单萜烯、倍半萜烯、二萜烯都具有较好的抗菌活性[6,26],对微生物有抑制作用[27-28]。罗汉柏烯(8 096.91 μg/g)、柏木脑(3 775.98 μg/g)、(+)-花侧柏烯(696.65 μg/g)这三种物质占总含量的88.803%,是柏木粉主要的挥发性成分。罗汉柏烯为目前香料工业中重要原料[29]。柏木醇具有膏香、木香,且香气持久,作为优良的定香剂,用于调配檀香、木香、花香、辛香、东方香型等日用香精,也用作消毒剂、卫生用品的增香剂[30]。柏木脑是杉木精油具有抗蚁、抗螨、抗菌功效的主要活性成分[31]。

2.4 柏木粉易挥发成分抑菌性能

柏木粉易挥发成分抑菌效果如图6所示。图6(a)中空白对照组平菇菌落直径为7.70 cm,供试组平菇菌落直径为4.75 cm,柏木粉易挥发成分对平菇菌的抑菌率为61.95%。图6(b)中空白对照组尖镰孢黄瓜专化型菌菌落直径为7.10 cm,供试组菌落直径为4.65 cm,柏木粉易挥发成分对尖镰孢黄瓜专化型菌的抑菌率为57.11%。图6(c)中,空白对照组胶孢炭疽菌菌落直径为7.70 cm,供试组菌落直径为5.40 cm,柏木粉易挥发成分对胶孢炭疽菌的抑菌率为50.82%。由此可见,柏木粉易挥发成分对平菇菌、尖镰孢黄瓜专化型菌、胶孢炭疽菌具有一定的抑制作用。通过考察不同种类柏木粉易挥发成分的抑菌效果,以及运用建立的SHS-GC-MS分析柏木粉挥发物组成的方法确定不同种类柏木粉易挥发成分组成,实验结果表明:在确定结构的化合物中,对供试菌有抑制作用的物质可能是萜类化合物。这与“2.3节”柏木粉易挥发成分分析结果相吻合,说明柏木粉具有的生物学活性可能与其易挥发成分的主要组分萜类化合物有关。但柏木粉易挥发成分对供试菌有抑制作用的具体活性成分有待后续进一步研究。

图5 柏木粉易挥发成分总离子流色谱图Fig.5 Total ion current chromatogram of the powders of C. funebris

表4 SHS-GC-MS分析柏木粉易挥发成分结果

续表4 SHS-GC-MS分析柏木粉易挥发成分结果

续表4 SHS-GC-MS分析柏木粉易挥发成分结果

图6 柏木粉易挥发成分抑菌效果Fig.6 Inhibitory effects of the volatile compounds in the powders ofC. funebrison mycelial growth of plant pathogenic and wood-rotting fungi

3 结论

采用SHS-GC-MS联用技术分析柏木粉挥发物组成,对SHS进样条件及其GC-MS分离检测条件进行了系统的研究,建立了一种柏木粉易挥发成分的分析方法,共分离得到91种化合物,确定结构60种,占柏木粉易挥发成分总含量的96.018%。柏木粉易挥发成分抑菌性能的研究表明柏木粉易挥发成分对平菇菌、尖镰孢黄瓜专化型菌、胶孢炭疽菌具有一定的抑制作用，对供试菌有抑制作用的物质可能是萜类化合物。柏木粉具有开发为新型植物源杀菌剂的潜力,可为研发相似植物源木材防腐剂奠定理论基础。柏木粉易挥发成分的分析方法的建立及其抑菌性能的研究为柏木抑菌有效成分的筛选、木材防腐、植物病原菌防治及柏木粉的综合利用提供了一定的科学依据。