IVF/ICSI-ET/FET 后自然流产的胚胎染色体异常的相关因素分析

徐丽清 许虹 宋兰林 李红 全松

体外受精-胚胎移植（in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET）技术是治疗不孕症的有效方法，经过40余年的发展，妊娠率有了较大的提高，活产率亦有所增加，但并未达到令人满意的程度，文献报道的活产率徘徊于20% ～40%［1］。自然流产是降低活产率主要原因之一，也是IVF-ET 的主要并发症之一。目前研究认为其与自然妊娠发生自然流产类似，存在很多危险因素，且胚胎染色体异常为其最常见原因，但辅助生殖技术（assisted reproduction technology，ART）中自然流产及胚胎染色体异常的相关危险因素的研究仍非常有限。在中心的初步研究［1］基础上，本研究将进一步从多因素角度探讨ART后自然流产相关危险因素及其生物安全性。

资料与方法

一、资料来源

1.研究对象与分组

回顾性收集2008 年10 月至2012 年4 月于南方医科大学南方医院生殖中心行ART治疗后自然流产并在妇产科门诊行清官术+胚胎染色体检查的患者。纳入标准：单胎妊娠，男女方染色体无异常；排除标准：多胎妊娠者、孕期感染及有害物质接触史、患有严重内分泌或免疫性基础疾病、子宫解剖异常、完全性葡萄胎、信息不全者。ART治疗包括IVF、ICSI-ET 及FET。所有患者均已签署ART助孕及流产绒毛染色体检查的知情同意书。观察期内，新鲜及冷冻移植的所有妊娠周期共10 136 例，其中自然流产数1 118例，自然流产率为11.0%。最后共纳入115 例自然流产者，其中早期流产96 例（83.5%），晚期流产19 例（16.5%）。根据胚胎染色体结果分为正常组（41 例）和异常组（74 例）。研究对象的女性年龄为24～43 岁，男性年龄为26～51岁，既往自然流产次数为0～3次，BMI为16.6～27.6 kg/m2。

二、方法

1.诊断标准

自然流产诊断标准为经超声下确诊临床宫内妊娠后发生的小于28 孕周前胚胎及其附属物重小于1 000 g 的妊娠丢失；早期自然流产诊断标准为孕12 周前的自然流产，晚期自然流产诊断标准为孕12 周至不足28周的自然流产［3］。

2.ART助孕过程

采用黄体中期长方案（95 例）或拮抗剂方案（20 例）促排，根据中心常规进行超促排卵、取卵、胚胎移植、黄体支持及明确临床妊娠［4］。

3.取样及绒毛染色体检查方法

在清官术中，用无菌负压吸引管留取绒毛组织或胎儿组织，浸泡于生理盐水中，尽快送入实验室，以细胞培养法［5］检测胚胎染色体。

4.统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件，两样本均数比较采用t及t′检验，计数资料采用χ2检验，并采用单因素及多因素的二分类变量logistic 回归分析，方法选用向前逐步回归法（Forward：wald）。自变量进入回归模型的检验水准为0.05，剔除水准为0.10。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、胚胎染色体异常率及异常类型分布

IVF/ICSI 治疗后自然流产中胚胎染色体异常率为64.3% （74/115），其中非整倍体率为91.9%（68/74，包含5例非整倍体复合嵌合体），结构异常率5.4%（4/74），四倍体2例。非整倍体主要为常染色体三体（60例，占88.2%），其中包含5例双染色体三体。非整倍体常见类型的前5 位依次为16 三体（15 例）、15 三体（9 例）、X 单体（7 例）、7 三体（6 例）、21 及22三体（各5例）。

二、胚胎染色体正常组与异常组间的比较

1.一般资料比较

两组间的女性年龄比较，差异有统计学意义，且异常组明显高于正常组（P＜0.05）。异常组的男性年龄高于正常组，但差异无统计学意义（P=0.063）。既往自然流产史、不孕症类型、多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）占比、既往自然流产次数、体重指数（body mass index，BMI）、血清基础卵泡刺激素（basal follicle-stimulating hormone，bFSH）及基础黄体生成素（basal luteinizing hormone，bLH）两组比较，差异均无统计学差异（P＞0.05）。详见表1和表2。

2.ART助孕资料比较

两组间的促性腺激素（gonadotrophin，Gn）总量和流产物性别间有显著差异（P＜0.05），染色体异常组的Gn 总量更多，而染色体正常组的女性胎儿更多，其男女性别比为1∶2.4，而异常组的性别比为1∶0.95。两组在Gn 刺激天数、促排卵方案、受精方案、移植方式、HCG 日雌二醇（HCG 日E2）、移植胚胎类型差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表1和表2。

三、受精方式与染色体异常类型

IVF 及ICSI 两种授精方式的主要染色体异常类型无显著差异，见表3。

四、绒毛染色体异常相关危险因素分析

经单因素及多因素logistic 回归分析均表明仅女性年龄为胚胎染色体异常发生的独立危险因素（P＜0.05），OR= 1.102，95%CI：1.008～1.204。其余指标均无统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

自然妊娠中自然流产率为10% ～20%［6］，很多文献已报道辅助生殖技术中的自然流产率与之无显著差别，本研究的数据提示IVF/ICSI 的自然流产率为11.0%。自然流产的发生是胚胎染色体、子宫、内分泌、免疫、凝血异常等多因素作用所致，而胚胎染色体异常为最主要的胎儿因素。自然妊娠中胚胎染色体异常率为45.70%～82.4%［7-9］，而ART中为53.2%［10］～66.67%［11］。其主要原因可能与研究对象的平均年龄差异、绒毛染色体的检测技术等有关，比如FISH 技术针对常见的7 条染色体进行检测［8］，而细胞培养法可能面临培养失败及母体细胞污染等问题［12］，从而导致检出率偏低。本研究采用细胞培养法，绒毛染色体总异常率为60.9%，与文献报道一致。但从流产物染色体正常组的男女性别比失调（1∶2.4）可以看出，细胞培养法容易出现母体细胞优势生长，从而可能降低绒毛染色体异常检出率。

无论是自然妊娠还是ART助孕妊娠，女性年龄都是发生绒毛染色体异常的独立危险因素［9，13-15］。虽然男性生育力不会像女性那样快速衰退，但也有研究表明男性年龄也与自然流产有关。一项12 710例妊娠的回顾性研究［6］发现，在校正了女性年龄等影响因素后，≥50岁男性的自然流产风险是28～29岁男性的2.5（1.06～2.20）倍。而这可能与精子染色体异常增加有关，有研究表明每过10年，男性的精子染色体异常的危险就增加17%［16］。女性≥35 岁且男性≥40 岁的夫妇发生自然流产的风险会更大［17］。本研究的单因素及多因素分析均提示女性年龄是绒毛染色体异常组的独立危险因素，而染色体异常组与正常组间的男性年龄差异无统计学意义，可前者的男性年龄更高（P= 0.063），可能与样本量偏少、研究对象中高龄的男性较少有关。

表1 胚胎染色体正常组与异常组计数资料比较［%（n）］

表2 胚胎染色体正常组与异常组计量资料比较［x±s］

表3 IVF及ICSI两种受精方式的绒毛染色体异常的主要类型发生率比较［%（n）］

基于对复发性流产的认识，随着流产次数及再发流产的风险增加［13，18］，既往流产次数是否与胚胎染色体异常相关仍存在争议。有研究认为自然流产次数与绒毛染色体异常率无关［10］，而对反复多次自然流产的研究发现流产物胚胎染色体异常率与流产次数呈负相关［9，19］。本研究提示既往自然流产次数与绒毛染色体异常无关。结论的不一致考虑与研究的对象、样本量及流产次数的分组标准不同等有关，本研究中的平均既往自然流产次数仅为（0.30±0.577）次，既往多次自然流产者比例不高。

PCOS 是ART 助孕人群中的常见生殖内分泌疾病，往往合并有肥胖、胰岛素抵抗等内分泌代谢问题，从而引起流产、妊娠期糖尿病等多种妊娠相关并发症［17，20］。本研究并未发现PCOS 与流产绒毛染色体异常无关，提示PCOS 本身并不增加胚胎染色体异常率。

此外，ART 助孕中促排卵方案、受精方案、ET/FET 等操作技术是否会导致胚胎染色体异常增加是ART技术中备受关注的安全性问题，然而由于纳入人群、研究设计及统计方法的不一致，研究结论仍存在争议。

国内外多项研究均表明ART技术并不增加自然流产及流产绒毛染色体异常率［13，21］的风险；但具体的染色体异常类型可能存在差异，比如ART助孕后的流产物多倍体率低于自然妊娠者［15］，而更容易出现21-三体［15］或X-单体［11］。

Gn 剂量是否对胚胎染色体造成影响也是备受关注的，虽有研究表明高Gn 剂量可能导致胚胎染色体非整倍体率增加［22-23］，但更大样本的研究表明在PGS 周期中增加Gn 使用剂量并不导致胚胎非整倍体增加［24-25］。本研究中单因素分析虽提示胚胎染色体异常组的Gn 总量更高，但经校正其他因素的影响后，发现其并非胚胎染色体异常的危险因素，Gn 总量高考虑与女性年龄有关，高龄女性容易出现卵巢储备功能减退或反应不良，往往需要更高剂量的Gn 刺激。笔者暂未发表数据提示，在胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）技术中，高孕激素下促排卵（progestin primed ovarian stimulation，PPOS）方案、拮抗剂方案、长方案的胚胎整倍体率并无差异。

ICSI 技术主要适用于男性严重少弱畸形精子症患者，精子的性染色体容易出现二体性及二倍体性［26］，进而可能导致染色体异常胚胎形成概率增加。但研究表明ICSI 周期与IVF 周期的自然流产绒毛染色体异常率及分布并无差异［14］；且对因非男性因素行ICSI的助孕周期的研究亦佐证了ICSI技术并未增加流产绒毛染色体的异常率及改变染色体分布［7］。本研究与上述研究相符，这可能与ICSI 前进行了精子的优化筛选及异常染色体精子形成的胚胎卵裂率下降而导致未被移植有关，且ICSI技术本身可能并不增加自然流产率及流产物染色体异常率。

FET 技术的安全性亦受到广泛关注。有研究提示FET 周期的自然流产绒毛染色体异常率与ET 周期无统计差异［10，27］。本研究亦提示ET与FET周期无差异，提示FET是一种安全的ART技术。

胚胎质量是妊娠成功的关键因素，是胚胎着床和胚胎进一步发育的必要条件。随着冷冻术的发展及选择性单胚胎移植的推广，囊胚移植越来越多，已有大量文献报道了囊胚移植较卵裂期移植可以提高种植率及活产率［28］，相应地降低了自然流产率。PGT 技术的应用进一步证实了囊胚期的胚胎染色体异常率低于卵裂期胚胎［29］。本研究中胚胎染色体异常组与正常组间的移植胚胎类型差异并无统计学意义，考虑研究期间仍以卵裂期胚胎移植为主，囊胚移植率低，此外本研究的样本量偏小，有待扩大样本量特别是囊胚移植后发生自然流产的病例以待进一步研究。

综上，本研究表明仅女性年龄是ART助孕中胚胎染色体异常的独立危险因素，促排卵方案、受精方式及移植方式等ART技术并不增加胚胎染色体异常率。本研究仍存在样本量较小，胚胎染色体检测方法单一、囊胚移植比例低等问题，有待更大样本量、不同绒毛染色体检测方法、更细致的分组来探讨ART技术与流产物胚胎染色体异常间的关系。