可溶性HLA-G和Toll样受体2、Rta基因在传染性单核细胞增多症中的表达及相关性分析

韩红满，秦伟，左立辉，刘贵敏，李四强

传染性单核细胞增多症属于一种较为常见的感染性疾病，好发于儿童时期，由EB病毒(EBV)感染所致的全身免疫异常性疾病，此病主要特征表现为发热、肝、脾、淋巴结肿大、咽颊炎、外周血异型淋巴细胞增多等[1]。临床研究发现[2]，B细胞为原发性EBV感染的初始靶细胞，当B细胞被病毒感染后，会经自身特定抗原表达，之后经病毒基因、病毒编码产物对细胞基因的表达产生影响，最终引发传染性单核细胞增多症。近年来，传染性单核细胞增多症的发病率显著上升，且呈现逐年升高的趋势，但目前对于此病发生的具体机制尚不完全明确[3]。为寻找早期诊断传染性单核细胞增多症的特异性指标，本研究选取医院收治的传染性单核细胞增多症患儿，检测可溶性人类白细胞抗原-G(sHLA-G)、Toll样受体2(TLR2)、Rta的表达，并分析其相关性，明确三者是否参与此病的发生发展，为其诊断提供参考，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2019年12月中国人民解放军陆军第八十二集团军医院血液内分泌科诊治EBV感染所致的传染性单核细胞增多症患儿80例作为观察组，男44例，女36例，年龄2～11(6.3±3.8)岁；病程3～28(15.5±10)d；病理分期[4]：前期25例，中期34例，后期16例，末期5例。另外选取同期于医院行健康体检的健康儿童80例作为健康对照组，男38例，女42例，年龄2～12(6.5±4.4)岁。2组研究对象在性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：观察组符合EBV感染传染性单核细胞增多症的诊断标准[5]，临床症状表现为发热、咽炎、扁桃体炎、颈部淋巴结、肝脾肿大；初次发病；外周血异型淋巴细胞阳性、血清嗜异性凝集试验阳性和EB阳性；均未接受疾病相关治疗；近半年无病毒感染史、无合并症。(2)排除标准：免疫调节剂使用史者；细胞毒性药物、糖皮质激素类药物滥用史者；免疫缺陷病者；噬血细胞综合征者；其他病毒感染者；精神障碍者；心肺功能不全者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血浆sHLA-G检测：采集2组研究对象入院次日和观察组患儿进入恢复期清晨空腹静脉血6 ml EDTA抗凝，3 ml离心取血浆，-80℃保存备用。采用酶联免疫吸附法检测sHLA-G水平，将血浆置于室温后，取出试剂盒，标记酶标板，制作标准品，以1∶2的稀释液稀释样品；在反应孔上依次加入稀释好的待测血清及标准品100 μl /孔，放置37℃恒温孵育箱中湿育2 h；用专用洗涤液将反应板清洗3次后，加入抗体工作液(1∶100倍稀释后)100 μl /孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45 min；继续清洗反应板4次后，在反应孔内加入TMB溶液100 μl /孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45 min后在反应孔内加入终止液100 μl /孔，在酶标仪上读取A405吸收值，分析sHLA-G水平。

1.3.2 TLR2、Rta mRNA检测：应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法，取上述血液3 ml，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离得单个核细胞，提取总RNA，使用Takara逆转录试剂盒行逆转录处理后获得cDNA，之后使用Primer 5.0软件对引物序列进行设计，采用2-△△Ct方法计算出外周血单个核细胞中TLR2、Rta表达量；TLR2引物序列：上游5’-ATTGTGCCCATTGCTCTTTC-3’，下游5’-CTTCCTTGGAGAGGCTGATG-3’；Rta引物序列：上游5’-AATTTACAGCCGGGAGTGTG-3’，下游5’-AGCCCGTCTTCTACCCTGT-3’；内参基因GAPDH引物序列：上游5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’，下游5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

2 结 果

2.1 2组sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA 表达比较 观察组sHLA-G表达水平、TLR2 mRNA、Rta mRNA表达量均高于健康对照组 (P<0.01)，见表1。

表1 2组受试者sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA表达比较

2.2 观察组不同病理分期sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA表达比较 传染性单核细胞增多症患儿sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA表达量比较，前期<中期<后期<末期，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 观察组不同病理分期sHLA-G、TLR2、Rta表达比较

2.3 观察组不同临床分期sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA表达比较 80例患儿经规范治疗后进入恢复期，急性期传染性单核细胞增多症患儿sHLA-G表达水平、TLR2 mRNA、Rta mRNA表达量均高于恢复期，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 观察组不同分期sHLA-G、TLR2、Rta 表达比较

2.4 各指标间相关性分析 Pearson相关性分析显示，sHLA-G与TLR2 mRNA、Rta mRNA呈正相关(r/P=0.404/0.001、0.240/0.032)，TLR2 mRNA与Rta mRNA亦呈正相关(r/P=0.271/0.015)，见图1。

3 讨 论

传染性单核细胞增多症发生后多数患者均表现为不同程度的免疫功能紊乱现象，人类白细胞抗原G(HLA-G)属于一种免疫调节因子，主要包括可溶性HLA-G(sHLA-G)、膜结合型HLA-G(mHLA-G)2种表达形式[6]。研究发现[7]，HLA与宿主免疫系统免疫应答相关，在此过程中具有重要的意义，HLA-G属于非经典的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子，位于人6号染色体短臂上，最早在母胎界面绒毛膜滋养层细胞表面发现。目前临床上已经证实[8]，HLA-G具有抑制细胞因子释放、NK细胞杀伤效应、树突状细胞抗原递呈、TH细胞辅助功能及CTL杀伤作用等功能，且上述功能均与病毒感染细胞免疫逃避相关。目前外周血sHLA-G已经用于机体免疫耐受性的诊断中，EBV感染的传染性单核细胞增多症患儿血浆sHLA-G水平与外周血淋巴细胞亚群的关系表明，sHLA-G在传染性单核细胞增多症患儿血浆中异常高表达，且与机体免疫相关[9-10]。基于上述研究，在本研究中分析sHLA-G与传染性单核细胞增多症的关系，结果显示，sHLA-G在传染性单核细胞增多症患儿血浆中高表达，且与患儿疾病分期、疾病严重程度相关，提示sHLA-G参与传染性单核细胞增多症的发生发展，表现为异常高表达，与上述研究结果保持一致。

机体抗感染免疫的第一道防线为天然免疫，Toll样受体属于跨膜信号传递受体，为天然免疫模式识别受体的重要组成成分，参与病原微生物识别、天然免疫触发、获得性免疫过程[11-12]。TLR2为Toll样受体家族成员之一，为机体抗感染免疫反应中最为直接的一种模式识别受体，在所有细胞系中均有表达，存在于细胞表面，且其在Toll样受体家族中为识别配体最多的成员[13-14]，EBV可经其信号转导通路将免疫细胞激活，使其产生过多的炎性因子，参与病理过程。研究发现[15-16]，EBV衣壳蛋白经TLR2配体所诱导的单核细胞—巨噬细胞使TLR2异常高表达，激活炎性因子，最终作用于抗EBV免疫反应过程。在本研究中进一步证实，TLR2在传染性单核细胞增多症中高表达，且参与此病的发生发展。孙丹等[17]在其研究中发现，传染性单核细胞增多症的患儿外周血单核细胞TLR2表达显著升高，证实TLR2参与传染性单核细胞增多症的发生发展，与本研究结果保持一致。

Rta是一种EBV复制转录激活子，为一种可调控病毒由潜伏期进入裂解期的启动子。Rta为BRLF1基因的蛋白产物，其组成包括605个氨基酸，N端的232个氨基酸为DNA的结合区域，与二聚体的形成有关，Rta DNA结合功能需二聚体形成参与[18-19]。临床研究显示[20]，Rta为一种具备序列特异性的DNA结合蛋白，可直接与BMLF1启动子区域相互作用，促进其表达，也可经间接结合机制发挥其激活作用。本结果证实Rta与传染性单核细胞增多症发生相关， Rta在传染性单核细胞增多症患儿血浆中高表达，且与患儿疾病分期、疾病严重程度相关，目前临床上对于Rta参与传染性单核细胞增多症的研究较少，且本研究样本量较少，上述结果还需后续研究进一步证实。

另外本研究还对sHLA-G、TLR2、Rta三者相关性进行分析，结果发现，三者之间均呈正相关，均在该病中高表达，共同参与该病的发生发展。

综上所述，sHLA-G、TLR2、Rta在传染性单核细胞增多症中均为异常高表达，且三者相关，共同参与此病的发生发展。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

韩红满：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；秦伟：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;左立辉：进行统计学分析;刘贵敏：课题设计，论文撰写；李四强：提出研究思路，分析试验数据，论文审核