高原地区颅脑损伤患儿血清HIF-1α、miR-210水平与继发性癫痫的关系

汪生毅，孙小红，李海栋，李佩章，王岁英，李玉鹏

高原地区低压、低氧环境严重影响心肺、神经系统功能，当出现颅脑损伤后，缺氧所导致的脑病理损伤加重，进一步加重病情，研究发现高原地区颅脑损伤发生率明显高于平原地区[1]。颅脑损伤后会引发一系列并发症，继发性癫痫(secondary epilepsy，SE)是颅脑损伤的并发症之一，病程较长，发展缓慢，其发生率为2%～40%，严重影响患者生活质量。颅脑损伤后SE的发生机制较复杂，目前尚无统一定论[2]。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是缺氧条件下发挥作用的特异性转录因子，研究证实脑组织缺氧后，组织中HIF-1α水平升高对脑组织具有一定的保护作用[3-4]。微小RNA-210(miR-210)主要存在于缺氧细胞及组织中，研究发现缺血缺氧脑损伤后，脑组织miR-210表达上调，可促进血管再生[5]。然而HIF-1α、miR-210水平与颅脑损伤后SE的关系，目前尚不明确。现对高原地区颅脑损伤患儿血清HIF-1α、miR-210表达进行检测，并分析两者与颅脑损伤后SE的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月—2019年2月青海省妇女儿童医院收治高原地区颅脑损伤患儿236例作为研究对象，根据是否发生SE分为SE组(52例)与无SE组(184例)。SE组男34例，女18例，年龄5～13(5.65±1.27)岁；格拉斯哥昏迷(GCS)评分(12.07±1.42)分；惊厥发作次数<6次18例，≥6次34例；损伤原因：击打伤6例，挤压伤8例，撞击伤12例，摔伤21例，其他复合伤5例；损伤类型：开放性损伤31例，闭合性损伤21例；损伤部位：额叶19例，其他部位33例；合并脑挫裂伤35例，颅内血肿21例，颅骨骨折30例，蛛网膜下腔出血23例。无SE组男113例，女71例，年龄4～13(6.02±1.31)岁；GCS评分(13.53±1.24)分；惊厥发作次数<6次124例，≥6次60例；损伤原因：击打伤23例，挤压伤29例，撞击伤42例，摔伤76例，其他复合伤14例；损伤类型：开放性损伤77例，闭合性损伤107例；损伤部位：额叶75例，其他部位109例；合并脑挫裂伤62例，颅内血肿20例，颅骨骨折25例，蛛网膜下腔出血31例。2组患儿性别、年龄、损伤原因、损伤部位比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而GCS评分[6]、惊厥发作次数、损伤类型、合并脑挫裂伤、颅内血肿、颅骨骨折、蛛网膜下腔出血比较差异具有统计学意义(t=8.915,χ2=18.173、5.156、18.921、24.604、44.124、17.228，P均=0.000)。以HIF-1α表达量中位值1.77和miR-210表达量中位值1.64将患儿分为低表达亚组与高表达亚组。本研究经医院伦理委员会批准，患儿家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①年龄≤13岁；②经临床、影像学等检查确诊为脑损伤；③患儿住院期间临床资料完整。(2)排除标准：①合并脑炎如麻疹脑炎、化脓性脑膜炎；②中枢神经系统感染；③先天性脑血管畸形或脑发育异常造成的癫痫；④癫痫家族史；⑤颅脑损伤前有癫痫病史。

1.3 血清HIF-1α、miR-210水平检测 患儿入院后采集空腹外周静脉血3 ml， 离心收集上层血清，在-20℃冰箱内保存备用。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清HIF-1α、miR-210水平。采用Trizol试剂(北京百奥莱博科技有限公司)提取血清中总RNA，参照逆转录试剂盒(杭州主诺生物技术有限公司)将RNA反转录为cDNA，反应体系为20 μl：2倍反应缓冲液2 μl，MgCl24 μl，OligodT引物1 μl，AMV Reverse transcriptas 0.6 μl，RNA抑制剂0.5 μl，RNA 1 μl，灭菌水10.9 μl。反应程序为42℃ 温育1 h，95℃热激 5 min，4℃保存10 min，反应结束后，收集cDNA，进行qRT-PCR反应，使用iQ5 Real Time型PCR仪(美国Bio-Rad公司)进行PCR扩增(PCR扩增试剂盒购自生工生物工程上海股份有限公司)及熔解曲线分析。配制反应体系50 μl：反应缓冲液5 μl，Taq酶0.5 μl，dNTP 4μl，Pmix 2.5 μl，上下游引物分别为1 μl，灭菌水36 μl。扩增条件：94 ℃预变性5 min，随后94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，进行35个循环。HIF-1α以β-actin作为内参，miR-210以U6作为内参，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，引物序列见表1。采取2-ΔΔCt算法定量评估HIF-1α、miR-210相对表达量。

表1 HIF-1α、miR-210引物序列

2 结 果

2.1 2组血清HIF-1α、miR-210水平比较 SE组患儿血清HIF-1α、miR-210表达明显高于无SE组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 2组患儿血清HIF-1α、miR-210水平比较

2.2 SE组患儿血清HIF-1α、miR-210在不同临床参数中表达比较 SE患儿HIF-1α、miR-210高表达者较低表达者GCS评分降低、惊厥发作≥6次比例增加(P<0.05)，与损伤类型、合并症比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同临床参数SE患儿血清HIF-1α、miR-210表达的比较

2.3 SE患儿HIF-1α、miR-210相关性分析 Pearson相关性分析发现，SE患儿HIF-1α与miR-210呈正相关(r=0.671，P=0.000)，HIF-1α、miR-210与GCS评分呈负相关(r=-0.571、-0.608，P均=0.000)，与惊厥发作≥6次均呈正相关(r=0.635、0.691，P均=0.000)。

2.4 影响颅脑损伤患儿继发性癫痫的危险因素 将颅脑损伤患儿发生继发性癫痫为因变量，以GCS评分、惊厥发作次数、损伤类型、合并症、HIF-1α、miR-210作为自变量进行Logistic多因素回归分析，结果显示GCS评分低、惊厥发作次数≥6次、合并颅内血肿、合并蛛网膜下腔出血、HIF-1α高表达、miR-210高表达是影响颅脑损伤患儿继发性癫痫的独立危险因素，见表4。

表4 Logistic回归分析影响颅脑损伤患儿继发性癫痫的危险因素

2.5 HIF-1α、miR-210在颅脑损伤患儿继发性癫痫中的预测价值 HIF-1α对颅脑损伤患儿继发性癫痫预测的AUC为0.874(95%CI0.823～0.928)，最佳截断值为1.48，敏感度为75.67%，特异度为86.75%，约登指数为0.624；miR-210对颅脑损伤患儿继发性癫痫预测的AUC为0.856(95%CI0.804～0.898)，最佳截断值为1.43，敏感度为73.08%，特异度为88.05%，约登指数为0.611，见图1。

3 讨 论

继发性癫痫又称获得性癫痫，患者由于神经元异常放电造成中枢神经功能暂时失常，常见的致病原因主要有颅脑损伤、颅内感染、颅内肿瘤等[7]。SE发生机制较复杂，目前尚未完全明确。颅脑损伤后可导致脑出血、脑挫裂伤，进而引发脑部缺血缺氧，使大脑神经元异常放电从而引发癫痫，因此颅脑损伤程度严重者发生继发性癫痫的风险较高。本研究发现，SE组患儿GCS评分低于无SE组，GCS评分低是影响颅脑损伤患儿继发癫痫的独立危险因素，提示颅脑损伤程度越高，发生继发性癫痫风险越高。以往研究发现，穿透性颅脑损伤患者发生癫痫的风险较高[8]。本研究结果显示，与无SE组相比，SE组患儿开放性颅脑损伤比例较高，但与继发性癫痫无关，说明虽然开放性颅脑损伤患儿继发性癫痫发生率较高，但并不是影响继发性癫痫的独立危险因素，可能因纳入患儿数量不多导致。既往研究发现，多次惊厥是SE发生的危险因素之一[9]，本研究结果显示，惊厥发作次数≥6次是颅脑损伤患儿继发性癫痫的危险因素，与既往研究相一致，提示频发惊厥的颅脑损伤患儿发生继发性癫痫的风险较高。此外，研究显示合并颅内血肿、蛛网膜下腔出血也是影响继发性癫痫发生的危险因素，临床针对此类患儿应高度重视，采取有效措施预防治疗，以降低其发生率。

HIF-1α为缺氧状态下产生的活性转录因子。以往研究发现，脑损伤发生后脑组织中HIF-1α表达明显升高，且HIF-1α分泌至血液中，使血清中HIF-1α表达上调，激活下游靶基因的转录，上调血管内皮生长因子(VEGF)或其他因子表达，促进受损血管修复，加速新生血管形成，发挥对脑组织的保护作用[10]。此外研究发现，颅脑损伤后脑组织中HIF-1α表达显著升高，且6 h内维持较高水平，可上调神经细胞对缺氧的耐受性[11]。Li等[12]研究发现，HIF-1α可通过介导Notch信号参与急性癫痫发生，阻断该通路后可下调HIF-1α，降低癫痫发生率。Yang等[13]研究发现，硒诱导的癫痫过程中，HIF-1α可通过肿瘤坏死因子-α途径造成神经细胞死亡。以上研究均表明HIF-1α与脑损伤及癫痫的发生有关，然而HIF-1α与脑损伤后继发癫痫的关系，目前尚不明确。本研究发现与无SE组相比，SE组患儿血清HIF-1α表达显著升高，进一步发现其与GCS评分呈负相关、与惊厥发作次数呈正相关，表明脑损伤程度越高，惊厥发作次数越多，则HIF-1α表达越高，提示HIF-1α参与颅脑损伤后继发性癫痫发生过程。ROC分析发现HIF-1α对颅脑损伤患儿继发性癫痫预测的AUC为0.874，最佳截断值为1.48，敏感度为75.67%，特异度为86.75%，约登指数为0.624，提示HIF-1α对颅脑损伤患儿继发性癫痫具有一定的预测价值。

大量研究证实，miRNA异常表达与脑部疾病的发生有关，Feng等[14]研究发现，缺血再灌注大鼠脑组织中miR-301a显著升高。Wang等[15]研究发现，脑梗死大鼠脑组织中miR-155-5p表达明显升高，抑制miR-155-5p可增强脑细胞活力。以上研究均表明miRNA与脑部疾病的发生明显有关。miR-210是与缺氧有关的miRNA，与组织缺氧/缺血、肿瘤及炎性反应的发生有关。Wang等[16]研究发现，脑梗死患者血清miR-210表达显著升高。Liu等[17]研究发现，miR-210在胶质母细胞瘤中表达下调，且与患者预后不良有关，进一步研究发现miR-210通过靶向脑源性神经营养因子(BDNF)抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移、侵袭。然而目前miR-210与颅脑损伤的关系尚不明确。本研究发现与无SE组相比，SE组患儿血清miR-210表达显著升高，且与GCS评分呈负相关，与惊厥发作次数呈正相关，提示血清miR-210表达水平的增加与颅脑损伤后继发性癫痫发生有关。ROC分析发现，miR-210对颅脑损伤患儿继发性癫痫预测的AUC为0.856，最佳截断值为1.43，敏感度为73.08%，特异度为88.05%，约登指数为0.611。提示miR-210在颅脑损伤患儿继发性癫痫中具有一定的预测价值，有可能作为此类患儿诊断标志物。研究发现miR-210可通过靶基因参与细胞增殖、凋亡、血管生成等过程，HIF-1α可结合miR-210转录位点上游的低氧反应元件，进而调节miR-210表达[18]。Wang等[19]研究发现，上调HIF-1α/miR-210信号通路，可减轻低氧性脑损伤大鼠细胞凋亡及线粒体能量代谢紊乱。Liu等[20]研究发现，miR-210通过靶向HIF-1α保护肾细胞免受缺氧诱导的凋亡。本研究发现miR-210与HIF-1α呈明显正相关，推测在颅脑损伤时患儿脑组织出现缺血缺氧，miR-210表达升高，造成HIF-1α表达增加，使脑组织对缺血环境产生适应性变化。

综上所述，在颅脑损伤患儿血清中miR-210、HIF-1α表达的增加与继发性癫痫发生有关，可作为判断颅脑损伤继发性癫痫的潜在生物学标志物。然而本研究仅初步探究两者的相关性，具体机制尚不清楚，仍需后续深入探究，以期为疾病的诊疗提供充分的理论基础。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

汪生毅：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；孙小红：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；李海栋：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；李佩章：进行统计学分析；王岁英、李玉鹏：课题设计，论文撰写