工程酵母INVSC1与H1246的生长与目标化合物积累的比较

李 宏，刘萌萌，唐中伟，李友莲

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

随着基因组学和代谢工程技术的不断发展，各种代谢途径的关键酶基因得到广泛的研究，相关的工程酵母也逐渐被大家关注。酵母与动物、植物都为真核生物，具有生长繁殖较快、代谢周期较短、容易分离和培养等特点，可广泛应用于构建真核生物模型，研究相关目的基因的功能等。酿酒酵母是单细胞真核微生物，属于酵母属（Saccharomyces）酿酒酵母种（Saccharomyces cerevisiae）。工程酵母INVSC1就是酿酒酵母中的一个重要代表种，又称酿酒酵母INVSC1（CerevisiaeINVSC1），它生长繁殖较快，代谢周期较短，发酵工艺简单，成本低廉，容易分离和培养，而且全基因组比较小，遗传代谢背景比较清楚，具有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达调控系统机制，是外源基因[1]表达最为理想的真核生物表达系统，由于易于对其基因组进行连锁分析、分子克隆及序列检测等，所以，还可广泛应用于构建真核生物模型和绘制更加详细而精准的遗传谱图，为人类的遗传疾病治疗和检测水平提供强有力的支撑。

油脂是高级脂肪酸与甘油形成的酯，即三脂酰甘油（TAG）。三脂酰甘油的生物合成途径主要是甘油-3-磷酸（Gly3P）和脂酰辅酶A（acyl-CoA）为前体并在内质网酰基转移酶作用下通过多步生物反应合成的。其最后一步反应在二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT）作用下形成。三脂酰甘油还可由PDAT途径合成，即磷脂和二酰甘油在磷脂二酰甘油酰基转移酶（PDAT）的作用下反应生成TAG和溶血磷脂[2-3]。

H1246是酵母突变体TAG缺陷型的酵母菌株，该菌株中调控编码TAG合成的DGA1（编码DGAT）、LRO1基因（编码PDAT）以及ARE1和ARE2基因（编码胆固醇脂的合成）均已被敲除，可用于鉴定植物、动物和微藻等真核生物三脂酰甘油（TAG）合成途径中DGAT或PDAT的活性[4-5]。三脂酰甘油（TAG）可以由DGAT和PDAT途径合成[6]，由于H1246是TAG缺陷型酵母菌株，因而，不能通过上述途径合成和积累TAG。而工程酵母INVSC1是正常型的酵母菌株，可以合成和积累TAG，用来验证相关目的基因的功能等。

近年来，在工程酵母的研究与应用方面取得了长足的进展。如赵伟军[7]利用代谢工程技术对工业酿酒酵母菌株合成S-腺苷蛋氨酸（SAM）的代谢网络进行优化和改造，大幅度提高了该工业菌株生产SAM的能力；傅盈盈等[8]以油菜菌核病原菌为试验病菌，工程酵母INVSC1在温度28℃条件下培养繁殖20 h后，经测定，当接种量为5% 时，INVSC1对油菜菌核病原菌的抑菌效果最好；李媛等[9]通过对酿酒酵母基因工程菌的构建和工艺优化的研究以及加强对细胞代谢工程、基因组学、蛋白组学的商讨，从而获取了更多酵母的相关基因信息；王珍[10]通过对圆红冬孢酵母细胞内的DGAT基因进行鉴定和功能性分析，确定了产油酵母圆红冬孢酵母中只有RtDGATb具有DGAT的活性，并和油脂积累相关联，是调控油脂积累过程中的关键因素。这些成果为工程酵母各个方面的研究奠定了基础。

本研究以工程酵母INVSC1和H1246为研究材料，通过培养并测定INVSC1与H1246的生长曲线，经尼罗红染色、苏丹黑染色、总脂肪酸含量测定、脂肪酸分析及薄层色谱分析等研究，分析工程酵母INVSC1与H1246的生长状况及目标化合物积累情况，旨在为后期油脂代谢相关基因功能验证等分子生物学试验提供基础，同时为酵母互补试验提供一定的科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试工程酵母INVSC1和H1246由山西农业大学分子农业与生物能源研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 生长趋势测定

1.2.1.1 培养基的配制及接种 分别称取4 g酵母膏、8 g蛋白胨、8 g无水葡萄糖于1 000 mL容量瓶中，向容量瓶中加入400 mL蒸馏水，振荡使其混合均匀制备为YPD液体培养基。将液体培养基于灭菌锅高温（120℃）高压（33.78 kPa）中灭菌20 min。在已灭菌的YPD液体培养基中分别接入20μL工程酵母INVSC1和H1246菌种。

1.2.1.2 菌液浓度的测定 将接完菌的液体培养基于温度30℃、转速180 r/min的空气浴振荡器中振荡，每2 h用移液枪分别吸取工程酵母INVSC1和H1246的培养基液体3 mL于2个比色皿中，以未接种酵母的YPD液体培养基作为对照，用紫外可见分光光度计测量其吸光度[11]并记录数据。

1.2.2 工程酵母INVSC1和H1246菌株的尼罗红染色[12]观察 将INVSC1与H1246的菌液离心并将二者菌株汇集起来，蒸馏水洗涤二者的沉淀，稀释菌体沉淀，将菌液OD600调整至0.2～0.3（菌液浓度过高影响染色效果）。分别向菌液中依次加入菌液100μL、蒸馏水850μL、二甲基亚砜（DMSO）50μL、尼罗红染液（5 mg/mL）10μL，强烈振荡混合均匀5 s，避光染色1 min，用荧光相差显微镜观察蓝色激发光下酵母的染色情况，并记录结果。

1.2.3 酵母中性油脂的检测 将INVSC1与H1246的菌液离心并将二者菌株收集起来，然后用蒸馏水洗涤二者的沉淀，并将菌体沉淀稀释，将菌液OD600调整至0.4～0.5。用无菌水重悬菌体沉淀，混合均匀后5 000 r/min离心5 min，倒掉上清液，分别向INVSC1与H1246的离心管中加入3 mL 0.3% 的苏丹黑[13-14]染液，染色15 min后于8 000 r/min下离心3 min后去掉上清液，分别向离心管中加入10 mL 70% 的酒精溶液混合均匀后离心去掉上清液，重复3次。用无菌水重悬菌体沉淀测OD580值，并记录数据。

1.2.4 工程酵母INVSC1和H1246目标化合物的提取与分析

1.2.4.1 总脂肪酸的提取 分别称取50 mg充分研磨的工程酵母INVSC1与H1246酵母粉末于50 mL离心管中，加入7.5 mL的氯仿-甲醇（体积比为1∶2）混合溶剂，将离心管置于温度37℃、转速200 r/min的空气浴振荡器中抽提24 h。离心后收集上层有机相，向剩余的样品残渣再加入7.5 mL的氯仿-甲醇（体积比为1∶2）混合溶剂重复抽提12 h，并离心收集上层有机相，抽提3次并合并有机相。向收集上层有机相的离心管中加入5 mL氯仿溶液，9 mL 1% 的氯化钠溶液，混合均匀后8 000 r/min离心10 min，收集下层有机相到已经称质量的指形管中，水浴锅加热至有机相挥发并用烘箱烘干，冷却至室温后称取指形管质量，计算脂肪酸总量[15-17]。每组3次重复。

总脂肪酸含量＝（提取后总质量－提取前管质量）/酵母菌粉质量 （1）

1.2.4.2 酵母脂肪酸成分分析 通过高速冷冻离心机将工程酵母INVSC1与H1246酵母冷冻24 h即可得到二者的干燥菌体。用分析天平分别称取100 mg工程酵母INVSC1与H1246的干燥菌体并用液氮将其研磨成粉末，之后向工程酵母INVSC1与H1246中分别加入1.5 mL提取buffer（含2.5% 浓硫酸的甲醇，V/V），并且用水浴锅80℃温浴2 h，待二者冷却至室温后分别向其中加入2 mL 0.9% （V/V）氯化钠和1 mL正己烷，轻轻振荡混合均匀后在室温条件下4 000 r/min离心10 min。取二者上清液并真空抽干，将沉淀用50μL乙酸乙酯溶解。在提取过程中加10μL C17∶0内标。

通过GC System测定工程酵母INVSC1与H1246酵母的脂肪酸含量。色谱柱采用BPX-70柱，毛细柱采用30 mm×0.25 mm，设定GC的升温程序：初始温度设定为120℃并保持1 min，色谱柱的温度以10℃/min的速率上升至150℃，然后再以4℃/min的速率让色谱柱温度上升至230℃并保持10 min。分别取其1μL样品上样后检测其脂肪酸含量[18]。每组3次重复。

1.2.5 薄层色谱分析（TLC） 在硅胶板的下端1.5 cm处用毛细管依次均匀点上TAG标样、工程酵母INVSC1和H1246总脂肪酸，点样斑点直径不大于0.5 cm，每样间隔2.5 cm，待斑点溶剂挥发干后将硅胶板放入展开剂（按照正己烷∶乙醚∶甲酸＝40∶1∶1（体积比））饱和的层析缸中进行展开。当上行展开溶剂前沿距硅胶板上端约2 cm处时，将硅胶板取出并晾干[19]。等展开剂挥发后，将硅胶板放置于染色碘缸中进行染色，确定斑点位置。每组3次重复。

2 结果与分析

2.1 菌液浓度的测定结果

微生物生长曲线一般包括迟缓期、对数期、稳定期3个阶段。从图1可以看出，工程酵母INVSC1与H1246的生长时期有着明显的区别，INVSC1在0～8 h处于迟缓期，8～18 h处于对数期，18～28 h处于稳定期；H1246在0～12 h处于迟缓期，12～22 h处于对数期，22～28 h处于稳定期。由此可知，在相同的生长条件下，工程酵母INVSC1比H1246生长快，先进入对数生长期和稳定期。此外，从图1还可以看出，工程酵母生长的每个阶段有不同的特点，迟缓期测定的浓度与刚开始时测定浓度一样；对数期菌的生长速度大大加快，单位时间内菌液的浓度增加量保持一致并达到最大值；稳定期测定的菌液浓度增加量最小，基本上为0。

2.2 工程酵母INVSC1和H1246菌株的尼罗红染色观察结果

从图2可以看出，通过明场和荧光场的比较，工程酵母INVSC1经过尼罗红染色细胞呈橘红色，内部有明亮的油滴，因为尼罗红会与中性油脂发生结合，并且在蓝色激发光下发出荧光。而H1246经过尼罗红染色后细胞也呈橘红色，但是内部未见到油滴。

2.3 酵母中性油脂的检测结果

经苏丹黑染色后工程酵母INVSC1与H1246中性油脂被染成了黑色，苏丹黑附着在油脂上，故吸光度会提高。将2种酵母的初始悬浮液OD值都调至0.4左右，染色后，工程酵母INVSC1的OD580值明显比H1246高，工程酵母INVSC1的OD580值在0.9左右，而H1246的OD580值在0.65左右（图3）。

2.4 总脂肪酸的测定结果

2.4.1 脂肪酸的提取结果 由图4可知，工程酵母INVSC1的总脂肪酸含量明显比H1246的高，工程酵母INVSC1的总脂肪酸含量大约在20% 左右，而H1246的总脂肪酸含量大约在10% 左右。

2.4.2 酵母脂肪酸各成分分析 从图5、6可以看出，工程酵母INVSC1含有3种不同的脂肪酸，H1246则含有2种不同的脂肪酸，而它们的目的峰分离效果较为明显，基线也比较平稳，没有重叠和拖尾等现象，能够准确判断脂肪酸的类型及其相对含量，它们的出峰时间依次为C16∶0（棕榈酸）、C16∶1（棕榈油酸）、C18∶1（油酸）、C18∶2（亚油酸），每种脂肪酸所对应的峰面积越大，相对浓度越高，含量就越高[20]。

由表1和图7可知，工程酵母INVSC1中棕榈酸和油酸相对含量较高，而棕榈油酸的相对含量非常低，几乎没有，所以，INVSC1中脂肪酸的主要成分是棕榈酸（C16∶0）和油酸（C18∶1），而H1246中棕榈酸（C16∶0）和亚油酸（C18∶2）的含量很少，几乎没有。

表1酵母脂肪酸组分分析

2.5 薄层色谱分析（TLC）测定结果

由图8可知，工程酵母INVSC1在硅胶板上有明显的TAG，而H1246则没有，即酵母INVSC1能正常合成积累TAG，而H1246则不能。

3 结论与讨论

本研究通过培养工程酵母并测定其生长曲线，经尼罗红染色、苏丹黑染色、总脂肪酸含量测定、酵母脂肪酸成分分析以及薄层色谱分析等一系列试验，结果表明，在相同的生长条件下，工程酵母INVSC1合成的油脂多，H1246基本上不合成油脂，可以比较出正常酵母和缺陷酵母合成和积累油脂的能力，即正常酵母比缺陷酵母产油脂能力强，从而为后期油脂代谢相关基因功能验证等分子生物学试验提供研究材料和研究基础。阳天泉等[3-4]在研究小桐子磷脂二酰甘油酰基转移酶时，通过工程酵母的互补试验得出，INVSC1能合成积累TAG，而H1246不能，且他在研究烟草二脂酰甘油酰基转移酶基因时，通过TLC层析试验、尼罗红染色、酵母油脂含量试验也得出了这个结论。谭太龙等[18]通过薄层色谱分析试验研究得出，INVSC1能合成积累TAG，而H1246则不能。本试验所获得结果和前人的研究结果是一致的。

本研究还表明，工程酵母INVSC1与H1246的脂肪酸成分及含量也各不相同，可以提取不同的脂肪酸应用于分子生物学试验、医疗保健、农药含量检测等方面，为工程酵母INVSC1与H1246的进一步研究奠定研究基础。