流式细胞术鉴定苹果花药培养再生植株倍性的方法

邓 舒，张春芬，肖 蓉，曹秋芬

（1.山西农业大学果树研究所，山西太原030031；2.山西农业大学生命科学学院，山西太原030031）

苹果栽培历史悠久，是世界重要的栽培果树之一。目前苹果育种主要采用常规杂交育种。由于其高度杂合的基因型以及自交不亲和现象的存在，苹果纯合系的获得很困难，育种周期长，效率低。而利用生殖细胞培养诱导形成植株，是获得纯合基因型植株的重要方法[1]。

苹果花药培养获得的纯合基因型植株来源于不同的花粉，这些小孢子来源的单倍体植株生存困难，多数植株在生长过程中会发生加倍现象，生成纯合二倍体、三倍体、四倍体甚至非整倍体植株；但也有一部分小孢子仍然维持原来的倍性，形成单倍体植株[1]。由于基因组的不同倍性对植株的性状、育性等方面都有重要的影响。因此，对花药离体培养获得的植株进行倍性鉴定，是研究苹果纯合新种质，进行育种与遗传分析的必要手段之一。

传统的倍性鉴定主要采用根尖压片与染色体计数法。这种方法虽然直观、精确、可靠，但操作复杂，对技术要求也较高，耗时耗力，不适宜进行快速、批量的鉴定。流式细胞术是对处在液流中的微粒进行快速分析和分选的技术。利用流式细胞术可以准确地检测细胞中DNA含量，进而通过与对照植株的DNA含量对比，确定待测植株的倍性。其是一种简单、快速的植物倍性鉴定方法[2-3]。近些年，利用流式细胞仪检测植物倍性的技术已经在梨、苹果、草莓、猕猴桃、枣、山楂、石榴等果树中得到了应用[4-12]。植物细胞往往含有次生代谢物，同一种解离液在不同物种不同组织的效果并不相同，没有植物上普遍适用的解离液。

本研究针对苹果花药再生纯合植株，对试验中的关键因素——解离液的配方进行探索，通过对4种解离液的试验结果进行比较分析，选出适宜的解离液，建立利用流式细胞术鉴定苹果花药再生植株倍性的方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为嘎啦苹果花药培养获得的纯合体组培苗。

1.2 试验设计

试验共设置4种解离液。（1）LB01 lysis解离液。15 mmol/L Tris；2 mmol/L EDTANa2；0.5 mmol/L四盐 酸 精 胺；80 mmol/L KCl；20 mmol/L NaCl；0.1% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通过0.22μm的过滤器过滤除去杂质，加入15 mmol/Lβ-巯基乙醇，于-20℃贮藏。（2）Galbraith's解离液。45 mmol/L MgCl2；20 mmol/L MOPS；30 mmol/L柠檬酸钠；0.1% （V/V）Triton X-100；pH值7.0。通过0.22μm的过滤器过滤除去杂质，于-20℃保存。（3）Tris-MgCl2解离液。200 mmol/L Tris；4 mmol/L MgCl2；0.5% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通过0.22μm的过滤器过滤除去杂质，于4℃贮藏。（4）WPB解离液。200 mmol/L Tris；4 mmol/L MgCl2；2 mmol/L EDTANa2；86 mmol/L NaCl；10 mmol/L焦亚硫酸钠，1% PVP-10；1% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通过0.22μm的过滤器过滤除去杂质，于4℃保存。

试验中有2种贮藏液，第1种为PI贮藏液，将PI粉末溶入水中，终浓度为1 mg/mL，通过0.22μm的过滤器过滤除去杂质，-20℃保存；第2种为RNase贮藏液，将RNase粉末溶入水中，终浓度为1 mg/mL，加热煮沸15 min，除去DNase，通过0.22μm的过滤器过滤除去杂质，-20℃保存。

1.3 细胞核悬液制备

细胞核悬液按照文献[2]的方法进行。将苹果组培苗叶片放入培养皿中，加入1 mL预冷的提取液，在液体中用锋利的刀片快速对叶片进行切割，然后在冰上放置1 min，用移液枪混匀几次，通过0.037 mm尼龙筛网过滤，保留过滤液（约500μL）。将过滤液放入离心机1 000 r/min，4℃，离心5 min。弃上清后，加入200μL预冷的解离液，再加入10μL PI贮藏溶液和10μL RNase贮藏溶液，轻柔混匀。同时另设一组处理，过滤液不经过离心，直接加入20μL PI贮藏溶液和20μL RNase贮藏溶液，轻柔混匀。制备好的细胞核悬液冰上放置15 min，上机检测。

1.4 流式细胞分析

试验所用流式细胞仪为BD公司的Accuri_C6流式细胞仪。采用488 nm紫外激光光源，采集通道为FL-2。样品流速设定为慢速（12μL/min）。每个样品采集5 000个颗粒进行DNA含量分析。

2 结果与分析

从苹果花药培养获得的再生植株中，取已知倍性的单倍体植株与二倍体植株各1株，分别采集其叶片，利用4种解离液制备的细胞核悬液进行染色，然后分别上机进行DNA含量检测与倍性分析。结果表明，不同的解离液处理后，检测所形成的峰的形状和杂带的大小均有区别。

LB01 lysis解离液检测结果表明（图1），单倍体和二倍体再生植株均可以获得较清晰的主峰，但单倍体的杂峰相对较多。

Galbraith's解离液的检测结果表明（图2），无论 单倍体还是二倍体均主峰明显，杂峰少。

Tris-MgCl2解离液的检测结果表明（图3），二倍体主峰不明显，峰值不高；单倍体虽能分辨出主峰，但峰形差，杂峰高。

WPB解离液的检测结果表明（图4），无论单倍 体还是二倍体，其主峰高且明显，杂峰低，峰形较好。

在单倍体和二倍体植株中，利用LB01 lysis、Galbraith's、WPB这3种解离液解离苹果的叶片细胞均能够检测苹果叶片细胞的DNA含量、分出DNA的主峰，但WPB的峰更高、更明显，且杂峰更小，表明WPB是最适宜苹果花药培养再生植株倍性鉴定的解离液，Galbraith's和LB01 lysis次之，而Tris-MgCl2不适合苹果再生植株的倍性鉴定。

对4种解离液细胞核悬浮液离心处理的试验结果表明，离心后颗粒信号收集慢，虽然降低了杂峰，但是主峰也相应减小、不明显。检测结果没有未经离心的悬浮细胞核效果好。因此，细胞核悬浮液不进行离心，染色后直接上机检测为宜。

3 结论与讨论

随着植物倍性的增加，细胞中染色体的总数增加，DNA含量增加，经PI染色后，荧光强度也随之增强。通过流式细胞仪采集鉴定，测量出细胞中DNA含量的高低，再通过与已知倍性的标准植株对比，计算出待测植株的倍性。

不同的植物细胞含有的次生代谢物种类和含量不同，适宜的解离液也不同。如果解离液不适宜，会影响细胞核的游离和悬浮，无法获得准确的倍性结果或无结果。本研究对4种解离液进行了试验，旨在选出利用流式细胞仪鉴定苹果纯合植株的最适宜解离液和检测方法。结果表明，WPB为苹果花药培养再生植株倍性鉴定的最适宜解离液。

单宁酸是一种常见的酚类化合物，经常积累在植物，尤其是木本植物的各种组织中。有文献指出，植物细胞中的单宁酸对解离液会产生负面影响[13-16]。许多木本果树中，WPB解离液都表现出很好的适应性[17]。WPB由Tris-MgCl2优化而来，是单宁酸影响作用最小的解离液[18]。WPB除了含有螯合剂和无机盐之外，还含有1% 的Triton X-100，在所有文献报道的解离液中含量最高[19-20]。Triton X-100起到解离细胞、释放细胞核、减少核黏连的作用。PVP有助于消除酚类等黏性物质，再加上焦亚硫酸钠这种还原剂，能够防止次生代谢物质的氧化，使得WPB适合于对木本植物组织的细胞进行解离与倍性分析[17]。本研究中，可能是因为苹果组培苗叶片中单宁含量较少，Galbraith's、LB01 lysis虽然不及WPB的解离效果好，但仍然可以应用于苹果再生植株的组培苗倍性鉴定。此外，制备的细胞悬浮液不经离心，直接染色后上机检测，更适合苹果组培再生植株的检测。